Les cellules ont été traitées en présence du milieu de culture à une distance de 2 mm au dessus de la surface du milieu (figure 106). Les paramètres utilisés pour créer le plasma gun
A
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A891 étaient les suivants : tension de 13 kV, fréquences de 200 Hz ou 2 kHz et flux de gaz variant de 170 ml/min à 480 ml/min pour l’hélium et de 150 ml/min à 200 ml/min pour le néon.
La différence entre les flux d’hélium et de néon s’explique par le fait qu’ils ne se mélangent pas de la même façon avec l’air. Nous avons donc choisi des flux de gaz permettant d’obtenir un jet de plasma d’apparence de diamètre et d’intensité lumineuse similaires.
Figure 106 : Traitement in vitro des cellules en plaque 24 puits
Après le traitement, les cellules ont été incubées à nouveau durant 24 h à 37°C sous 5% de CO2 avant d’être imagées par bioluminescence.
3.2.4.2. Traitement in vivo
Avant de commencer le premier traitement (4 jours post-induction), les animaux ont été randomisés en 3 groupes de 8 animaux sur le critère de l’intensité de bioluminescence.
• Groupe contrôle, traité uniquement avec le flux de gaz hélium à 340 ml/min (Ctrl)
• Groupe traité au plasma gun généré dans l’hélium (Plasma He)
• Groupe traité au plasma gun généré dans le néon (Plasma Ne)
Les animaux ont subi 3 séances de traitements de 10 min au plasma gun espacés de 10 jours. Afin de suivre l’évolution tumorale, une imagerie de bioluminescence a été réalisée une fois par semaine jusqu’au 36e jour post induction (figure 107). Le protocole expérimental a
Développement d’une nouv ommandations du Comité Local d’Ethique t selon la Directive Européenne 86/609/EEC.
a thérapeutique du traitement au plasma gun hé
ment au plasma gun était la suivante : les ,5% dans l’air). Une petite incision au niveau liser le pancréas et la tumeur primaire. Les masse chauffée à 37°C et la tumeur primaire a égatif) soit au plasma gun hélium ou néon. L
m de la tumeur primaire (figure 108).
raitement de la tumeur primaire au niveau du p A : Plasma hélium, B : plasma néon.
pour créer le plasma gun étaient les suivants : e gaz de 340 ml/min pour l’hélium et 140 ml/m aitement, le pancréas était replacé dans sa pos
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A9A1 3.2.5. Traitement par bithérapie plasma gun/gemcitabine
Afin d’améliorer les effets du plasma gun, nous avons choisi de l’associer à une chimiothérapie. Compte tenu des effets radiosensibilisants de la gemcitabine, en particulier sur les cellules de cancers pancréatiques (Lawrence, et al., 1996), et de la similitude des effets des plasmas froids avec la radiothérapie, nous avons décidé d’associer en bithérapie le plasma gun et la gemcitabine.
3.2.5.1. Traitement in vitro
La concentration inhibitrice 50 (IC50) de la gemcitabine étant de 7 nM, valeur préalablement déterminée dans le Chapitre 2 (paragraphe 2.3.3.4.1), une concentration de 5 nM, inférieure à l’IC50, a été choisie pour le traitement en bithérapie avec le plasma gun.
Ainsi, afin de tester l’effet d’une association plasma gun/gemcitabine, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 50 000 cellules/puits. Après 24 h d’incubation à 37°C sous 5 % de CO2, la gemcitabine a été ajoutée dans le milieu de culture à la concentration de 5 nM. Les cellules ont à nouveau été incubées durant 24 h avant d’être traitées au plasma gun hélium à 2 kHz avec un débit de gaz de 480 ml/min.
3.2.5.2. Traitement in vivo
En tenant compte des résultats obtenus précédemment lors des traitements à la gemcitabine (Chapitre 2, paragraphe 2.3.3.4.2), la dose choisie pour le traitement en bithérapie est celle ayant permis d’obtenir le meilleur effet inhibiteur de la croissance tumorale, c'est-à-dire 200 mg/kg.
Après induction orthotopique de cellules MIA PaCa2-luc, les animaux ont été randomisés sur le critère de l’intensité de bioluminescence puis répartis en 4 groupes de 8 animaux.
• Groupe contrôle, recevant le véhicule de la gemcitabine (NaCl 0,9%) ainsi que le flux de gaz (Ctrl)
• Groupe traité à la gemcitabine seule à la dose de 200 mg/kg (GEM)
Développement d’une nouv iquement au plasma gun généré dans l’hélium (P a gemcitabine (200 mg/kg) et au plasma gun (Pl
ités avec la gemcitabine administrée par voie i local après externalisation du pancréas et de l récédemment.
gemcitabine ont reçu 5 administrations espac volume d’injection de 10 ml/kg. Les animaux es espacées de 10 jours à une fréquence de 2 k 340 ml/min.
citabine a été réalisée 24 h avant le traitement tré que lors d’une bithérapie gemcitabine/radio imaux lorsque la gemcitabine était admini , 2005).
e était donc le suivant :
thérapeutique du traitement au plasma gun et à
on tumorale, une imagerie de bioluminescence
e jour post induction, stade au-delà duquel l tenu du statut hypoxique de la tumeur.
1 1A921
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A931 3.2.6. Imagerie de bioluminescence
3.2.6.1. Imagerie in vitro
Après ajout de 15 µg/puits de luciférine et incubation à 37°C durant 5 minutes, l’imagerie a été réalisée avec un IVIS Lumina II (Caliper Life sciences). La bioluminescence a été quantifiée en traçant des ROIs autour de chaque puits et exprimée en photons/seconde (p/s).
La figure 110 présente un exemple d’image obtenue par bioluminescence après traitement des cellules au plasma gun.
Figure 110 : Imagerie de bioluminescence après traitement des cellules MIA PaCa2-luc au plasma gun durant différents temps
3.2.6.2. Imagerie in vivo
Les souris ont été injectées en i.p. avec de la luciférine (Proméga) à la dose de 100 mg/kg.
Cinq minutes après cette injection les animaux étaient maintenus sous anesthésie (2%
Isoflurane dans l’air) pour la durée de l’imagerie. Les acquisitions étaient réalisées au binning médium (4x4), durant un temps variable (dépendant de l’intensité du signal) allant de 5 à 300 secondes.
Comme déjà évoqué, l’imagerie de bioluminescence est une imagerie planaire et les problèmes dus à l’absorption des photons et à la localisation du pancréas nous ont obligés à réaliser les acquisitions sur les souris en faces antérieure et latérale gauche. Tous les résultats de bioluminescence présentés pour le modèle orthotopique du pancréas représentent la somme
20 s
40 s 30 s 10 s
Ctrl Blanc
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A941 de la bioluminescence corps entier des 2 faces (latérale + antérieure), en photons/seconde (p/s).
Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’augmentation par rapport au premier temps de bioluminescence (J3, avant premier traitement à la gemcitabine), chaque animal étant son propre témoin.