Afin d’évaluer l’effet du plasma gun sur la croissance des cellules MIA PaCa2-luc in vitro, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 24 puits puis traitées au plasma gun avant d’être imagées par bioluminescence.
3.3.1.1. Influence des caractéristiques du plasma
3.3.1.1.1. Impact du flux de gaz
Le flux de gaz joue un rôle important car il va modifier le mélange gaz/air et donc la nature des espèces qui vont arriver sur les cellules. Dans cette expérience, nous avons cherché à déterminer l’impact de ce flux de gaz sur les cellules. Les débits de gaz ont été choisis en fonction de la capacité à générer un jet de plasma, le débit de gaz minimum pour obtenir un jet de plasma étant de 85 ml/min en néon et de 170 ml/min en hélium. Le débit maximal a été limité par le matériel utilisé (débitmètre ne pouvant aller au-delà de 480 ml/min).
Après ensemencement des cellules et imagerie de bioluminescence les histogrammes suivants ont été tracés (figures 111 et 112).
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A961
Figure 111 : Traitement durant 2 minutes à différents flux de gaz hélium Les résultats correspondent à la moyenne ± SEM (n=5).
*: p < 0,5 ; **: p < 0,01 (Test de Mann Whitney)
L’augmentation du flux de gaz permet d’améliorer significativement l’effet sur l’inhibition de la croissance cellulaire. Les différences observées sont significatives entre les flux de gaz testés. Après 2 minutes de traitement à 170 ml/min, la diminution de l’intensité de bioluminescence est de 18% par rapport au groupe contrôle (Ctrl), cette diminution passant à 63% lorsque les cellules sont traitées avec un flux de gaz de 480 ml/min.
Pour la suite des études, les traitements in vitro au plasma gun utilisant l’hélium ont donc été réalisés avec un flux de gaz de 480 ml/min.
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A971
Figure 112 : Traitement durant 2 min ou 4 min à différent flux de gaz néon Les résultats correspondent à la moyenne ± SEM (n=5). **: p < 0,01 (Test de Mann Whitney)
Des effets similaires ont été observés avec le néon. En effet, pour un même temps de traitement, plus le flux de gaz est élevé plus l’inhibition de la croissance cellulaire est importante. Lorsque les cellules subissent un traitement de 2 minutes, une diminution de 72%
par rapport au groupe contrôle est observée avec un flux de gaz à 150 ml/min. Cette diminution passe à 89% lorsque les cellules subissent le même traitement avec un flux de gaz de 200 ml/min.
Pour la suite des études, les traitements in vitro au plasma gun utilisant le néon ont donc été réalisés avec un flux de gaz de 200 ml/min.
3.3.1.1.2. Effet selon la nature du gaz
Le plasma pouvant être créé à partir de nombreux gaz, modifiant alors les espèces produites, nous avons voulu tester l’impact du type de gaz sur l’inhibition de la croissance des cellules tumorales.
Les cellules ont subi un traitement au plasma gun à une fréquence de 200 Hz. Les flux de gaz ont été appliqués en fonction des résultats obtenus précédemment, soit un flux de 480 ml/min pour l’hélium et de 200 ml/min pour le néon. Il a par ailleurs été montré que le flux de gaz (hélium ou néon) seul n’induisait aucun effet sur les cellules.
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A981 Les courbes représentant le nombre de cellules viables 24h après traitement au plasma gun en fonction du temps de traitement ont été tracées pour les deux gaz (figure 113) grâce aux valeurs déterminées par bioluminescence.
0 100 200 300 400
0 50 100
Plasma He Plasma Ne
Temps (s)
Cellules viables (%CTRL)
Figure 113 : Effet sur l’inhibition de la croissance cellulaire d’un traitement au plasma gun généré à partir de 2 gaz différents, le néon et l’hélium
Les résultats correspondent à la moyenne ± SEM (n=5).
Le temps nécessaire pour tuer 50 % des cellules a été déterminé selon la méthode de Hill slope. Il est de 83 secondes lorsque les cellules sont traitées avec le plasma gun généré dans l’hélium et de 78s lorsqu’il est généré dans le néon.
3.3.1.1.3. Impact de la fréquence de traitement
Comme le flux de gaz, la fréquence joue un rôle très important car elle va modifier le nombre d’espèces qui vont arriver sur les cellules en un temps donné. La fréquence a donc un impact direct sur la dose délivrée.
Après ensemencement des cellules selon la procédure décrite précédemment, celles-ci ont été traitées soit à la fréquence de 200 Hz soit à 2 kHz. En se basant sur l’imagerie de bioluminescence, une cinétique a été réalisée afin de déterminer le temps nécessaire pour tuer 50 % des cellules et les courbes correspondantes sont présentées figure 114.
Développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique, le plasma gun1 1A991
0 100 200 300 400
0 50 100
2 kHz 200 Hz
Temps (s)
Cellules viables (% Ctrl)
Figure 114 : Effet de la fréquence d’un traitement au plasma gun hélium Les résultats correspondent à la moyenne ± SEM (n=5).
Le temps nécessaire pour tuer 50 % des cellules a été déterminé selon la méthode de Hill slope. Il est de 108 secondes lorsque les cellules sont traitées avec le plasma gun à la fréquence de 200 Hz et de 19 secondes à 2 kHz.
Si l’on se réfère au nombre d’impulsions (fréquence x temps) nécessaires pour tuer 50%
des cellules, il faut à 200 Hz, 21 600 impulsions (200 x 108) et à 2 kHz 38 000 impulsions (200 x 19).
Ainsi, pour une fréquence faible le nombre d’impulsions nécessaires pour tuer 50 % des cellules est moins important que pour une fréquence plus élevée, mais le temps de traitement est cinq fois plus long. Compte tenu de l’importance de la durée du traitement pour les études in vivo (les souris ne peuvent pas rester anesthésiées pendant plusieurs heures) nous avons choisi de traiter les animaux à la fréquence de 2 kHz.
3.3.1.2. Effet d’une combinaison plasma gun/gemcitabine
Afin d’améliorer les effets obtenus avec le plasma gun seul sur l’inhibition de la croissance cellulaire, de la gemcitabine a été ajoutée dans le milieu de culture à la concentration de 5 nM 24 h avant traitement au plasma gun, temps optimal pour radiosensibiliser les cellules (Pauwels, et al., 2005).