Une solution mère d’acide okadaique (Sigma) à 50 nM est préparée dans de l’eau stérile. Les cellules MDA-MB231 réensemencées à 5 x 104 cellules/ml de milieu complet, sont traitées avec 500 nM d’acide okadaique pendant 6 heures.
C. Traitement par les antioxydants
Des cultures de cellules MDA-MB231 réensemencées à 104 cellules/ml de milieu complet, sont traitées avec un ou deux antioxydants à différentes concentrations à savoir :
1 et 5 mM de N-acétyl-L-cystéine (NAC) (Sigma) pendant 8 jours
2 et 10 mM de Pyruvate (Sigma) pendant 8 jours
2 μM de Mn(III) tetrakis (1-méthyl-4-pyridyl) porphyrin pentachloride (MnTMPyP) (Biomol international, Plymouth, USA) pendant 6 jours.
D. Traitement par les inducteurs du gène de la SOD Mn
A partir d’une culture de cellules MCF-7 réensemencées à 104 cellules/ml de milieu complet, des inducteurs du gène de la SOD Mn comme le Tumor Necrosis Factor Į (TNFĮ)
(LabFrontier, Séoul, Corée du Sud) ou le Phorbol 12-Myristate 13 Acetate (PMA) (Sigma), sont ajoutés au 6e jour de culture pour une durée de 12 heures de traitement. Les cellules sont traitées avec 20 ng/ml de TNFĮ et 200 nM de PMA, obtenus à partir de solutions mères respectivement à 1 μg/ml dans de l’eau stérile et à 100 μM dans du DMSO
(Diméthylsulfoxyde, Sigma). Les cellules traitées avec le PMA sont comparées aux cellules témoins cultivées dans un milieu contenant 0,2 % de DMSO.
3. Développement des modèles cellulaires transgéniques
A. Construction du vecteur plasmidique contenant l’ADN complémentaire inversé de la SOD Mn
A.1. Synthèse de l’ADNc par transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR)
La synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) de la SOD Mn humaine (668 pb) est réalisée à partir d’ARN totaux extraits des cellules MDA-MB231 (cf paragraphe III.1), à l’aide d’un kit commercial High fidelity Extensor PCR (AB Gene, Epsom, UK) permettant de synthétiser avec une grande fidélité les différents ADNc. La partie codante du gène est synthétisée entre les amorces sens (5’-GGACTGGGTACCAGCATG TTGAGCCGGGCAG-3’) et antisens (5’-CTGAGCTCTAGAGTTTACTTTTTGCAAGCCATG-TTGAGCCGGGCAG-3’), contenant respectivement les sites de coupure des enzymes de restriction Kpn I et Xba I (Promega, France). L’ADNc de DDB2 (1300 pb) a été préalablement synthétisé à partir d’ARN totaux extraits des cellules MCF-7 par RT-PCR en utilisant le même kit commercial que précédemment et les amorces sens GGACTGGGTACCACACGCAGGACGCGATGGCTC-3’) et antisens (5’-CTGAGCTCTAGATCACTTCCGTGTCCTGGCTTCC-3’) se terminant respectivement par les sites Kpn I et Xba I [Kattan et al. 2008a]. La PCR est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment.
Figure 25 : Représentation de la carte du vecteur plasmidique pcDNA3,1(+/-) (Invitrogen), utilisé pour l’insertion de l’ADNc correspondant à la SOD Mn.
La PCR est réalisée dans un volume final de 50 μl contenant 1 μg d’ADNc, le tampon d’incubation, 1,5 mM de MgCl2, 0,5 mM de déoxynucléotides triphosphates (dNTP), 0,5 μM de chacune des amorces et 2,5 unités de Taq polymérase. Le milieu réactionnel de PCR est placé dans un thermocycleur (BioRad) et soumis à une dénaturation initiale durant 2 min à 94°C, suivie de 10 cycles comprenant une dénaturation de 10 s à 94°C, puis 30 cycles avec une dénaturation de 20 s à 94°C, une hybridation à 53°C durant 30 s et une élongation à 68°C de 2 min. Ce programme est terminé par une élongation à 72°C durant 7 min.
Les fragments amplifiés sont analysés par électrophorèse en gel d’agarose à 1,2% (Life Technologies) préparé dans du tampon TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM Borate (pH 8), 2 mM d’EDTA) contenant 0,5 mg/ml de bromure d’éthidium (BET). Les échantillons sont repris par une solution comportant 50% de glycérol, 50% de TBE 1X et du bleu de bromophénol avant d’être déposés sur le gel. La séparation électrophorétique s’opère à voltage constant (100 V) pendant 35 min. Les fragments amplifiés sont visualisés sous UV grâce à la fluorescence du BET intercalé dans l’ADN. Le gel est calibré par un marqueur de taille connue (Smart Ladder, Eurogentec, Liège, Belgique) qui est déposé en même temps que les échantillons. L’exploitation des résultats est réalisée avec le logiciel Quantity One sur un appareil GelDoc 2000 (BioRad).
A partir d’une électrophorèse préparative, l’ADNc est purifié dans le gel à l’aide du kit commercial Prep A Gene (Bio-Rad).
A.2. Clonage de l’ADNc dans le vecteur plasmidique pcDNA3,1(-)
Le plasmide pcDNA3,1(-) (Figure 25) est digéré durant 1 heure à 37°C par les enzymes de restriction Kpn I et Xba I (Promega) à raison de 2 unités par μg d’ADN. L’ADNc purifié est également digéré par les mêmes enzymes de restriction dans les mêmes conditions. Après extraction des enzymes au phénol/ chloroforme, l’ADNc ainsi que le plasmide sont précipités par l’isopropanol, puis dissous dans l’eau distillée dans un volume minimum. Les extrémités cohésives du vecteur sont ensuite déphosphorylées par 0,1 unité de phosphatase alcaline de veau (Promega) durant 30 min à 37°C. A nouveau, l’enzyme est éliminée par une extraction au phénol/ chloroforme et le plasmide est précipité par 2,5 volumes d’éthanol absolu froid, avant d’être solubilisé dans l’eau à une concentration de 100 ng/μl. Le plasmide
est ensuite incubé avec l’ADNc préalablement digéré, en présence de 3 unités de ligase et d’un tampon d’incubation contenant 0,1 mM d’ATP (Promega) durant 5 min à température ambiante, selon un rapport ADNc/vecteur de 5. Les bactéries compétentes Escherichia Coli
(TG1) rendues compétentes par le CaCl2 [Sambrook et al. 1989] sont transformées avec l’ensemble de la réaction de ligation, par choc thermique à 42°C pendant 2 min, puis incubées sous agitation 1 h à 37°C en milieu LB (10 g/l tryptone, 5 g/l extrait de levure, 10 g/l NaCl, pH 7). Après étalement des bactéries sur boîte de pétri de 90 mm en milieu LB (LB contenant 20 g/l de bactoagar) et de l'ampicilline, les clones bactériens sont incubés une nuit à 37°C.
L’ADNc se retrouve ainsi dans une position inversée, en vue de synthétiser un ARN antisens de la SOD Mn.
Les plasmides de chaque colonie repiquée dans 20 ml de milieu LB contenant 20 μg d'ampicilline, sont extraits selon la méthode de lyse alcaline [Birnboim et Doly 1979] et précipités par l’isopropanol. La présence de l’insert est vérifiée à la fois par digestion enzymatique avec Kpn I et Xba I et par PCR à l’aide des amorces sens et antisens utilisés pour la synthèse de l’ADNc (Voir paragraphe 3.A.1). Chaque clone bactérien, révélé positif, est ensuite cultivé dans 300 ml de milieu LB contenant de l’ampicilline afin d’extraire et de purifier sur une résine d’hydroxyapatite, une grande quantité de plasmides, à l’aide d’un kit commercial contenant toutes les solutions nécessaires (Nucleobond, Macherey-Nagel, Allemagne). L’ADN plasmidique précipité, puis séché sous vide, est dosé au spectrophotomètre à 260 nm. Le séquençage de l’ADNc est réalisé par un séquenceur automatique (INRA, Champenoux).