Après chaque acquisition, les données sont analysées par les biologistes du laboratoire en utilisant le logiciel BD FACSDiva®. Afin d’éviter les éventuels biais inter-opérateurs, j’ai réexporté les données phénotypiques de l’ensemble des patients et réanalysé l’intégralité de ces données sur le logiciel FlowJo® (v10.6.2).
La stratégie de fenêtrage manuel consiste dans un premier temps à éliminer les débris cellulaires en posant un seuil arbitraire basé sur la taille à 50000. Ensuite, les lymphocytes sont sélectionnés selon leur faible granularité (SSC) et leur forte intensité du marqueur pan- leucocytaire CD45. Le fenêtrage des lymphocytes permet en même temps d’éliminer les blastes myéloïdes. Les cellules NK sont ensuite isolées au sein de cette population lymphocytaire sur la base de l’expression du marqueur CD56 et de l’absence d’expression du CD3 (Figure 47A).
La positivité des marqueurs NKp30 et NKp46 sur les cellules NK a été fixée selon le témoin isotypique et un témoin interne (les lymphocytes T CD3+ n’exprimant pas ces marqueurs) ; l’absence de « vallée phénotypique » étant fréquente dans l’expression de ces marqueurs (Figure 47B).
Enfin, les différentes sous-populations cellulaires NK selon leur profil de maturation ont été identifiées. Les cellules NK CD56bright sont les cellules NK circulantes les plus immatures. Elles ont été identifiées par la forte intensité d’expression du marqueur CD56 et l’absence d’expression du marqueur CD57. Les cellules NK CD56dim
(faible expression du marqueur CD56) ont été séparées en quatre sous-groupes selon l’expression des récepteurs KIR et du marqueur de fonctionnalité CD57 : les cellules NK KIR-CD57-, KIR+CD57-, KIR- CD57+ et KIR+CD57+ (Figure 47C). L’ensemble de ces quatre sous-populations cellulaires représentant 100% des cellules NK CD56dim et la somme des cellules NK CD56bright et CD56dim représentant 100% des cellules NK.
En 2017, une standardisation avait été effectuée entre les cytomètres de l’IPC et le cytomètre du CRCM, en utilisant 30 prélèvements de volontaires sains. Cette corrélation a permis de retrouver les seuils utilisés pour séparer les patients selon leur statut NKp46. Ainsi, les patients dont la MFI de NKp46 sur les cellules NK est supérieure à 2259 appartiennent au groupe NKp46high, ceux dont la MFI est inférieure à 2259 appartiennent au groupe NKp46low.
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Figure 47 : Stratégie de fenêtrage en cytométrie en flux.
(A) Les cellules NK sont identifiées selon leur phénotype CD3-CD56+.
(B) Détermination du seuil de positivité du marqueur NKp46 selon le contrôle isotypique (à droite).
(C) Identification des différentes sous-populations cellulaires NK selon leur profil de maturation : CD56bright et CD56dim (KIR-CD57-, KIR+CD57-, KIR-CD57+ et KIR+CD57+).
Contrôle isotypique Marqueur d’intérêt
Sur les cellules NK
A
B
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4. Analyse statistique
Les caractéristiques des patients ont été récoltées à partir de leur dossier médical informatisé (Hopital Manager) et actualisées jusqu’au 30 juin 2020, date autorisée par le directeur de la recherche clinique de l’IPC. Ces caractéristiques incluent l’âge au diagnostic, le sexe, l’étiologie (de novo, secondaire à un cancer solide ou une hémopathie maligne), le nombre de globules blancs, de blastes sanguins et médullaires au diagnostic, le caryotype ± la FISH, les mutations NPM1, FLT3 (ITD et exon 20), CEBPα et IDH1/2, la classification
morphologique FAB, cytogénétique et pronostique ELN, le traitement d’induction (selon le schéma « 3+7 », date de la première induction, nombre de cures), le traitement de consolidation (autogreffe, allogreffe, le cas échéant : date d’allogreffe, statut avant allogreffe), la réponse au traitement (rechute ± date de rechute) et la survie (décès ± date du décès, date des dernières nouvelles).
Ces caractéristiques ont été résumées par des analyses descriptives, incluant la fréquence, les pourcentages, la médiane, la moyenne et l’écart type (Tableaux 8 et 9).
Chez les patients ayant reçu un traitement d’induction intensif de type « 3+7 », l’évaluation de la réponse au traitement permet de classer les patients en trois groupes, selon les recommandations ELN 201718 :
- Groupe rémission complète (RC) : patients ayant obtenus une RC après une ou deux cures d’induction et n’ayant pas rechutés à la date des dernières nouvelles ;
- Groupe réfractaire : patients n’ayant pas atteint une rémission complète après une ou deux cures d’induction ;
- Groupe rechute : patients ayant obtenus une RC après une ou deux cures d’induction et ayant présenté une rechute cytologique post-RC.
La survie globale, la survie sans rechute et l’incidence cumulative de rechute ont été calculées selon les recommandations ELN 2017.18 Ainsi, la survie globale est définie de la date du diagnostic à la date du décès, quelle qu'en soit la cause ; les patients dont le décès n'était pas connu au dernier suivi étant censurés à la date des dernières nouvelles. La survie sans rechute est quant à elle mesurée de la date d’obtention d'une rémission complète jusqu'à la date de rechute ou de décès quelle qu'en soit la cause ; les patients dont la rechute ou le décès n'était pas connu au dernier suivi étant censurés à la date des dernières. L’incidence cumulative de rechute est mesurée de la date d’obtention de la rémission complète jusqu'à la
Page | 115 date de rechute ; les patients dont la rechute n'était pas connue au dernier suivi étant censurés à la date des dernières et les patients décédés sans rechute étant considérés comme une cause d’échec concurrente. Enfin, le suivi médian a été établit de la date de rémission complète à la date des dernières nouvelles.
Les tests statistiques ont été effectués avec les logiciels Microsoft_Excel (version 2019) et Graphpad Prism® (v7.0). Le test de Wilcoxon-Mann-Whitney a été utilisé pour la comparaison de deux groupes non appariés et le test de Kruskal-Wallis suivi d’un post-test de Dunns a été effectué pour les comparaisons multiples. Le test d’indépendance du 𝜒2, le test exact de Fisher et le t-test ont été utilisés pour comparer les variables initiales chez les patients ayant reçu ou non un traitement d’induction intensif et chez les patients présentant un phénotype NKp46high ou NKp46low. Les courbes de survie ont été estimées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier et la comparaison entre les sous-groupes a été réalisée par le test du log-rank. Le seuil de significativité a été fixé à p<0,05 pour l’ensemble des analyses.
II. Résultats
1. Analyse de la cohorte clinique globale
Parmi les 138 patients dont le statut de NKp46 a été obtenu, 16 ont été retirés de l’étude devant la présence de l’un de ces critères d’exclusions : 7 patients étaient atteints de leucémie aiguë promyélocytaire, 4 de leucémie aiguë lymphocytaire, 1 de lymphome agressif, 1 de SMD avec excès de blastes et 3 patients présentaient une LAM en rechute (dont le statut NKp46 n’avait pas été déterminé au diagnostic). Le statut phénotypique de NKp46 a donc pu être récupéré chez 122 patients atteints de LAM au diagnostic.