Traçage du fornix par injection cérébrale stéréotaxique de lentivirus chez les souris KO STOP

De nos jours, il est possible de suivre l☂intégralité d☂un neurone dans un cerveau d☂animal vivant par chirurgie stéréotaxique et injection d☂un lentivirus codant pour la GFP (Green Fluorescent Protein). Le lentivirus utilisé est le VIH (Virus de l☂Immunodéficience Humaine) qui a été inactivé et rendu non réplicatif, dont on a inséré la cassette du gène

codant pour la GFP. Ce virus est maintenant capable d☂infecter les neurones. Une fois injecté dans la structure d☂intérêt, il va infecter les neurones environnants, sa rétrotranscriptase va ensuite traduire son ARN (Acide RiboNucléotide) en ADNc (Acide

DéoxyNucléotide codant) afin que ce dernier puisse s☂intégrer à l☂ADN du neurone infecté. Tout neurone qui sera infecté exprimera la GFP de façon constitutive. La GFP elle, sera capable de diffuser le long de l☂axone et des dendrites du neurone et nous permettra ainsi de visualiser la morphologie des axones constituant le fornix. Cette technique pourra aussi nous permettre de mieux appréhender le cheminement précis des axones post-commissuraux du fornix chez les souris S^-/- et éventuellement de mettre en évidence des voies de projections anormales chez ces souris.

Nous avons choisi d☂infecter la partie dorsale du subiculum, en effet, comme nous le verrons dans le paragraphe suivant, une grande majorité des neurones de cette partie projette leur axone dans le corps mamillaire via la partie post-commissurale du fornix (figures 34 et 43). Après 15 jours d☂infection, nous avons fixé les souris et effectué des coupes sagittales de cerveau afin de visualiser l☂ensemble du fornix, comme pour la précédente étude. Chez les souris S+/+, les fibres (GFP+) du corps du fornix ont un aspect lisse, régulier et s☂organisent parallèlement (figures 39Ba et d). En revanche, à ce même niveau, les fibres fornicales des souris S^-/- arborent déjà un aspect différent : elles semblent beaucoup plus fines et le tract est moins organisé (figures 39Bg et j). L☂aspect des fibres est moins lisse et plus irrégulier (figure 39Bj). Cet aspect granulaire et la désorganisation du tract s☂accentuent au fur et à mesure de la ventralisation du fornix. Par ailleurs, nous pouvons voir apparaître de grosses varicosités dans les fibres de la partie proximale du fornix post-commissural chez les souris S^-/- (figures 39Bh, i, k et l). A ce même niveau, les fibres des souris S^-/- sont beaucoup moins nombreuses.

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Figure 39 : Etude morphologique des fibres axonales du fornix de souris sauvages (S^+/+) et invalidées (S^-/-) par traçage lentiviral. Partie 1.

A : gauche : Localisation schématique du site d☂infection lentivirale stéréotaxique du subiculum (S) sur une coupe sagittale de cerveau. Le carré noir indique la position du champ photographique équivalent au site d☂injection stéréotaxique du lentivirus codant pour la GFP. Droite : Mise en évidence du site d☂infection du lentivirus codant pour la GFP dans le subiculum (S). Le Nissl met en évidence les corps cellulaires des neurones du subiculum. La GFP met en évidence les neurones infectés par le lentivirus. Les neurones du subiculum infectés par le lentivirus sont doublement marqués Nissl/GFP. B : Les carrés roses et bleus indiquent la position des champs photographiques équivalents aux coupes sagittales des souris S^+/+ (a, b, c et d, e, f) et S^-/- (g, h, i et k, l, m) utilisées pour l☂analyse des fibres du fornix dorsal (fd) et de la partie proximale du fornix post-commissural (fp), respectivement. a, b, c : Photographies des coupes sagittales de souris S+/+ utilisées pour la visualisation des fibres vertes GFP⁺ du fornix. Les carrés roses et bleus indiquent la zone de visualisation des fibres observées au microscope confocal (d, e et f), grossissement x20. g, h, i : Photographies des coupes sagittales de souris S^-/- utilisées pour la visualisation des fibres vertes GFP⁺ du fornix. Les carrés roses et bleus indiquent la zone de visualisation des fibres observées au microscope confocal (j, k et l), grossissement x20. f : Grossissement x2 de l☂image b. l : Grossissement x2 de l☂image k. ac : commissure antérieure, cm : corps mamillaires.

Lorsque les fibres du fornix post-commissural des souris S^+/+ commencent à se ventraliser (figure 40a), nous retrouvons l☂aspect lisse et régulier de la partie dorsale. En revanche, la densité des fibres S^-/- chute et seulement quelques très fines fibres arrivent à progresser (figure 40i). Ces fibres forment un éventail, comme si elles se défasciculaient pour se perdre dans la masse tissulaire. Toutefois, il est possible, sur deux cerveaux de souris S^-/- de distinguer quelques rares fibres arriver au niveau du corps mamillaire (figure 40j). Chez les S^+/+ en revanche, un nombre de fibres plus important arrive sur le corps mamillaire (figure 40e). Si nous regardons au plus fort grossissement la zone d☂arrivée des fibres du fornix sur le corps mamillaire des souris S^+/+ (figures 40e et f), nous retrouvons des varicosités équivalentes à celles observées chez les souris S^-/- peu avant la zone où nous perdons la totalité des fibres (figures 39h, i, k et l). Nous pouvons penser que la présence de varicosités, à proximité des corps mamillaires, est le résultat d☂une formation synaptique au niveau des dendrites des neurones du corps mamillaire. Ces varicosités correspondraient donc aux boutons synaptiques. Il est donc possible qu☂une grande partie des axones du fornix des souris S^-/- essaierait d☂établir des connexions avec des neurones d☂une région cérébrale adjacente à la partie proximale du fornix post-commissural, plutôt que d☂aller connecter le corps mamillaire. Une autre interprétation de l☂aspect granulaire des fibres du fornix des souris S^-/- serait une dégénérescence axonale progressive. Par ailleurs, cette étude ne nous permet pas de déceler une autre voie de projection des fibres post-commissurales de fornix chez les souris S^-/-.

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Figure 40 : Etude morphologique des fibres axonales du fornix de souris sauvages (S^+/+) et invalidées (S^-/-) par traçage lentiviral. Partie 2.

Les neurones du subiculum infectés par le lentivirus sont doublement marqués Nissl/GFP. Les carrés noirs indiquent la position des champs photographiques équivalents aux coupes sagittales des souris S^+/+ (a, b, c et d, e, f) et S^-/- (g, h et i, j) utilisées pour l☂analyse des fibres de la partie post-commissurale du fornix. a, b, c : Photographies des coupes sagittales de souris S^+/+ utilisées pour la visualisation des fibres vertes GFP⁺ du fornix. Le carré noir indique la zone de visualisation des fibres observées au microscope confocal (d, e et f), grossissement x20. g, h : Photographies des coupes sagittales de souris S^-/- utilisées pour la visualisation des fibres vertes GFP⁺ du fornix. Le carré noir indique la zone de visualisation des fibres observées au microscope confocal (i, j), grossissement x20. f : Grossissement x2 de l☂image e. ca : commissure antérieure, cm : corps mamillaire.

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4.1.6 Analyse de l☂intégrité des afférences des corps mamillaires