Sommaire
Introduction . . . . 61 3.1 Principe duTethered Particle Motion (TPM). . . . 63 3.1.1 Préparation du support de l’échantillon . . . . 64 Préparation de la lamelle de verre . . . . 64 Dépôt de protéines . . . . 64 3.1.2 Préparation de la chambre enfermant l’échantillon . . . . 65 Préparation de la lame de verre . . . . 65 Assemblage de la chambre . . . . 66 3.1.3 Préparation des complexes ADN/particule . . . . 66 ADN . . . . 66 Coefficient de diffusion . . . . 67 Nanoparticules . . . . 67 Formation des complexes ADN/particule . . . . 68 3.1.4 Finalisation de l’échantillon . . . . 68
Diffusion de nos complexes ADN/particule dans la chambre mi-crofluidique . . . . 68 3.2 TPM-on-a-chip. . . . 68 3.3 Points forts duTPM-on-a-chip . . . . 69 3.4 Dispositif expérimental . . . . 70 3.4.1 Microscope à fond noir, ou en champ sombre . . . . 70 3.4.2 Caméra . . . . 71 Résolution temporelle . . . . 71 Résolution spatiale . . . . 72 Essais d’amélioration de notre résolution expérimentale . . . . 73 3.4.3 Dispositif de contrôle de la température . . . . 75 3.5 Principe d’une mesureTPM . . . . 76 3.5.1 Détection des complexes ADN/particule . . . . 76 3.5.2 Suivi des positions . . . . 77 Détermination de la zone d’analyse de l’objet . . . . 78 Détermination de la position de l’objet . . . . 78 Extraction des positionsXietYi de l’objet . . . . 78 3.5.3 Suivi des trajectoires . . . . 79 Extraction du point d’ancrage de l’objet . . . . 79
60 Chapitre3. Technique expérimentale :Tethered Particle Motion (TPM)
3.5.4 Correction de l’effet de dérive de la platine du microscope . . . . 80 Extraction de l’amplitude du mouvement l’objet . . . . 81 3.6 Filtres de sélection appliqués par le logicielNanoMultiplex . . . 81 3.6.1 Amplitude du point d’ancrage . . . . 82 3.6.2 Facteur de symétrie . . . . 82 Expression du facteur de symétrie . . . . 82 Valeur seuil du facteur de symétrie . . . . 83 3.7 Corrections et premières étapes de l’analyse de données . . . . . 85 3.7.1 Filtre sur le facteur de symétrie,FSym . . . . 87 3.7.2 Filtre sur les amplitudes,Aeq,i,j . . . . 87 Exclusion des nanoparticules se collant à la surface . . . . 87 Exclusion des nanoparticules se décrochant de la surface . . . . 87 3.7.3 Distribution des Aeq,[Moy],j . . . . 88 Construction de la distribution desAeq,[Moy],j . . . . 88 Filtre sur les Aeq,[Moy],j . . . . 89 3.7.4 Valeur brute de l’amplitude du mouvement . . . . 91 3.7.5 Correction de l’effet du moyennage vidéo . . . . 91 Fonction de corrélation des positions en phaseCm(0) . . . . 91 L’erreur de pointé . . . . 92 Fonction de corrélation des positions hors phaseCm(s) . . . . 93 Rapport des fonctions de corrélation . . . . 93 Extraction du temps de corrélation . . . . 94 3.7.6 Correction de l’effet du moyennage vidéo . . . . 94 Distribution desR||,i,j . . . . 94 Distribution desτ||,j . . . . 95 3.7.7 Filtre surτ|| . . . . 96 3.7.8 Distribution desR||,i,j . . . . 97 3.7.9 Filtre sur lesR||,i,j . . . . 97 3.8 MesuresTPM. . . . 100 3.8.1 Courbe de calibration . . . . 100 3.8.2 Extraction de la contribution de l’ADN seul . . . . 101 Méthode minimale . . . . 101 Méthode deSegall et al.. . . . 102 3.8.3 Extraction de la longueur de persistance . . . . 103 Conclusion . . . . 104
61
Introduction
L
acaractérisation de la molécule d’ADN suscite l’intérêt des chercheurs depuis de nombreuses décennies. Au vu de son rôle prédominant dans le fonction-nement de tout organisme, cet objet soulève de nombreux questionfonction-nements. Ces derniers peuvent concerner sa structure, son fonctionnement, ses propriétés phy-siques et chimiques, etc. Afin de répondre au mieux à ces questions, les approches expérimentales, ainsi que numériques comme nous le verrons juste après, se sont considérablement enrichies et développées. Le nombre de techniques expérimen-tales accessibles a explosé. La force de cette nouvelle vague de méthodes réside dans l’association de savoir-faire provenant directement du monde de la biologieavec une approche dumonde de la physique.
Toute étude pertinente despropriétés intrinsèquesà cette biomolécule, réside dans l’exploration de son comportement affranchi du maximum d’interférences possible. En effet, si nous cherchons, par exemple, à caractériser l’interaction spéci-fique de l’ADN avec la protéine IHF,Integration Host Factor, il est plus direct d’étu-dier l’interaction sur un système reconstituéin vitrodans lequel chaque partenaire protéique peut être isolé. Les recherches sur l’ADN ont donc suscité un besoin d’outils de caractérisation toujours plus précis et plus spécifiques. Ce cadre a donc favorisé le développement récent des approches à l’échelle de la molécule unique. Les dernières décennies du XXéme siècle, ont été le témoin de leurs premiers développements. Fin des années70, ces méthodes furent initialement utilisées pour le suivi de molécules ou protéines dans la cellule ou sur la membrane cellulaire. En effet, le travail de Hirschfeld permet la première détection optique et acquisition d’images de protéines individuelles [Hir76]. Cette avancée est suivie de près par la détection de canaux ioniques individuels dans la membrane cellulaire [NS76]. Ces papiers sont les pionniers de la technique de suivi de molécule unique. La transposition de cette dernière sur notre objet d’intérêt qu’est l’ADN, a eu lieu en 1991 grâce aux travaux de Schafer et al. [Dor91]. Dans cette étude, une molécule d’ADN est fixée sur une surface de verre, attachée via une protéine RNA polymé-rase. L’analyse de l’étendue spatiale du mouvement brownien de la particule d’or, greffée à l’autre extrémité de l’ADN, a permis de remonter au taux d’élongation de l’ARN polymérase. En effet, la variation de l’amplitude du mouvement brow-nien est directement liée aux variations de la longueur apparente de la molécule d’ADN, qui elle-même est directement assujettie à l’activité de cette protéine, Fig.
3.1.
Fig. 3.1 – Extrait de [Dor91]. Schéma de la première approche de suivi du mouvement d’une molécule d’ADN attachée à une surface.
62 Chapitre3. Technique expérimentale :Tethered Particle Motion (TPM)
Cette technique, où le mouvement de l’ADN n’est pas contraint par l’applica-tion d’une force extérieure, est le précurseur de l’approche que nous nommons aujourd’hui Tethered Particle Motion (TPM). Cette dernière est depuis large-ment utilisée [DZMF11]. Elle a permis d’approfondir les connaissances sur les mécanismes d’interactions ADN-protéines, la formation de boucles dans la mo-lécule d’ADN ou encore l’enroulement, complet ou partiel, de cette dernière sur elle-même. Les mécanismes et les effets liés à la présence d’une courbure dans la molécule d’ADN commencent à être prospectés. De plus, les conditions physicochimiques jouent un rôle important et peuvent modifier la rigidité de la molécule ou encore induire une dénaturation locale. L’étude de l’ensemble de ces modifications et changements conformationnels intervenant sur la molécule d’ADN nous permet d’affiner la compréhension de certains processus biologiques. En effet, ce type d’événement intervient lors des processus de transcription et/ou de recombinaison de l’ADN.
Par la suite, les approches de micromanipulation se sont répandues. Ces techniques permettent d’étudier la réponse de l’ADN lorsqu’il est soumis à une contrainte. Ces contraintes peuvent être d’extension ou de torsion, notamment par pince magnétique[LAR+12]. La gamme de forces explorées par ces techniques va généralement de quelques piconewtons à plus de100pN[NN08], voire à1000pN lors d’expériences en AFM [NN08]. La première micromanipulation de molécules d’ADN est réalisée par Smith et al. en 1992 [SFB92]. La technique utilisée repose sur la combinaison de pinces magnétiques et d’un flux hydrodynamique. Ainsi, l’extension d’une molécule d’ADN a pu être mesurée en fonction de la force qui lui est appliquée. De plus, leurs résultats expérimentaux ont été comparés avec les modèles de chaînes de polymères classiques de physique statistique. Cette comparaison a permis de souligner les limites du modèleFJCpour décrire le com-portement d’une molécule d’ADN d’environ 32 µm. En effet, l’absence de toute corrélation d’orientation sur les positions de la chaîne ne permet pas de décrire et d’expliquer leurs résultats. Plus tard, Marko et al. [MS95] ont démontré que le modèle WLC était mieux adapté pour décrire cette réponse élastique de l’ADN sous force. En effet, ce modèle considère l’ADN comme une chaîne possédant une courbure continue, sa capacité de flexion et son entropie contribuant à son énergie. Les approches à l’échelle de la molécule unique donnent accès à l’ensemble de la distribution de comportement d’une molécule individuelle et un accès di-rect à la cinétique des processus sans requérir de synchronisation. Ces mesures sont en opposition aux mesures réalisées grâce aux approches moyenne (en : bulk). Ces méthodes donnent une moyenne des grandeurs caractérisées. Notre but est d’étudier des variations conformationnelles à l’échelle de la molécule unique d’ADN. Il faut donc utiliser une technique expérimentale adaptée et pertinente à cette échelle de mesure. Tout d’abord, nous allons décrire leprincipe de la tech-nique expérimentaleutilisée ainsi que les grandes lignes de lapréparation de nos échantillons. Les détails du protocole sont décrits en Annexe A.1. Ensuite, nous expliciterons les routines d’extractions des données lors de la réalisation de nos expériences. Enfin, nous commencerons à décrire notre procédure d’analyse des données, commune à chacune de nos problématiques. Le script détaillé de cette analyse de données se trouve dans l’Annexe C.
3.1. Principe duTethered Particle Motion (TPM) 63
3.1 Principe du Tethered Particle Motion (TPM)
La technique de suivi de molécule unique utilisée se nomme en anglais
Te-thered Particle Motion, soit une traduction directe par mouvement de la particule
attachée. La mise en place de cette technique consiste à immobiliser une des extré-mités d’une molécule d’ADN sur un support solide, tandis qu’une nanoparticule, de rayon Rpar, est attachée à l’autre extrémité, libre, de l’ADN, Fig.3.2. Ainsi, les mouvements browniens observés au niveau de la nanoparticule nous servent de sonde afin de suivre les changements de conformation de la molécule d’ADN au cours du temps.
Fig.3.2–Schéma du principe du Tethered Particle Motion
Cette technique TPM permet de mettre en exergue la dynamique de confor-mations de la molécule d’ADN via la mesure de l’amplitude du mouvement du complexe ADN/particule soumis au mouvement brownien au cours du temps
L’élaboration de nos échantillons implique de suivre un protocole rigoureux pour la préparation de chacun des constituants. Les détails de ce protocole se trouvent àl’Annexe A.1, ainsi que les ajouts et modifications qui y ont été appor-tés durant ma thèse.
Dans la suite, seule une explication succincte du protocole est proposée (pas de détails des pré-parations des différentes solutions). Par contre, les tenants et aboutissants de nos différents choix liés au protocole, y sont présentés.
Les molécules d’ADN que nous cherchons à étudier sont contenues dans une chambre micro-fluidique. Celle-ci est constituée de 3 éléments principaux qui vont être assemblés, Fig.3.3. Une fois la chambre réalisée et fermée hermétique-ment, nous pouvons y introduire nos complexes ADN/particule via les ouvertures sur le dessus. Nous entamons la description des différentes élé-ments, schématisés ci-contre, en commençant de
64 Chapitre3. Technique expérimentale :Tethered Particle Motion (TPM)
3.1.1 Préparation du support de l’échantillon
Du fait de la taille nanométrique des objets que nous cherchons à étudier, la précision requise est très importante. De plus, comme pour toute expérience de ce type, la netteté et la fiabilité des traitements de surface sont cruciaux. En effet, il faut limiter, au maximum, la présence de contaminants qui pourrait interférer et/ ou interagir avec l’ADN.
Préparation de la lamelle de verre
La surface solide servant de support à notre molécule d’ADN est une lamelle de verre de microscope. Elle est préalablement nettoyée afin d’obtenir une surface exempte de tout contaminant et présente un état de surface le plus lisse et net possible.
Une quantification de cettepropretépeut être effectuée via une mesure dit d’angle de goutte. En effet, plus une surface est propre, plus elle est hydrophile. Plus une surface est hydrophile, plus une goutte d’eau va venir s’yétaler.
Nous pouvons voir l’évolution de l’angle de goutte au cours des étapes de nettoyage de la la-melle de verre,Fig.3.4 1),)2 et)3. Ensuite
seule-ment, nousépoxydonscette surface)4 . Fig.à différentes étapes du protocole3.4–Mesure des angles de goutte La phase d’époxydationcorrespond à la fonctionnalisation de substrat par une molécule chimique. Cette molécule possède la fonction époxy, qui permet la liaison covalente avec les groupements amines libres des protéines que nous viendrons
tamponner dessus. Une fois la surface époxydée, elle est mise en présence d’une solution contenant des molécules de polyéthylène glycol (PEG) ou de pluronique. Ce caractère tend à repousser stériquement les molécules d’ADN et les nanoparti-cules. Cela limite ainsi les adsorptions non spécifiques, et donc non désirées, sur cette dernière. Par contre, il ne faut pas que la surface soit la plus hydrophobe possible, sinon nous augmenterions la difficulté d’adsorption des protéines que nous souhaitons venir fixer sur la surface ainsi que la difficulté d’injecter de faible quantité de liquide dans notre chambre, elle-même de faibles dimensions. En effet, même à l’échelle de notre chambre micro-fluidique, les tensions de surface augmentent de façon importante.
Dépôt de protéines
Fig. 3.5 – Neutravidine (RCSB Protein Data Bank)
Une fois la lamelle époxydée nous pouvons venir y fixer des protéines. Dans notre étude nous travaillons avec de la neutravidinea qui est constituée de 4 uni-tés identiques, Fig. 3.5. Cette protéine possède une très forte affinité avec la biotineb. Cette interaction spéci-fique non-covalente met en jeu une énergie de l’ordre
de ∼ 32×Ethem [WWPS92]. Ce couple protéine-ligand
possède une des plus fortes énergies d’interaction. Les molécules de streptavidine ont une dimension∼5 nm.
a. Neutravidine : protéine de 64000 Da, neutre à pH 7.
3.1. Principe duTethered Particle Motion (TPM) 65
Nous utilisons une technique dite de micro contact printing qui nous permet de déposer les protéines sur la lamelle époxydée. Cette étape consiste à venir apposer pendant 1 min un timbre de Polydiméthylsiloxane, PDMS, structuré en une succession de plots, préalablement imprégnés avec une solution contenant les protéines.
Cette mise en contact du timbre en PDMS sur la surface époxyde, transfère les protéines d’une surface à l’autre, Fig. 3.6et 3.7. Ainsi, elles sont disposées sui-vant le motif définit par les plots du timbre de PDMS.
Fig.3.6–Schéma du dépôt de protéines Fig.3.7 – Visualisation par fluorescence d’un dépôt de protéines
En solution, soumis au mouvement brownien, les complexes ADN/particule que nous cherchons à ancrer sur les streptavidines, fluctuent au cours du temps. Ancré et fixé par une extrémité de l’ADN à la surface, le complexe peut explorer lors de ses mouvements une zone d’excursion limitée. Cette dernière dépend de la longueur de la molécule d’ADN ainsi que des dimensions de la nanoparticule. Un complexe ADN/particule ancré empêche, par répulsions stériques, l’accès à sa zone d’excursion à d’autres molécules.
Ainsi, la taille des zones imprimées est calibrée, selon l’estimation du rayon maximal du disque d’écrantage d’un complexe ADN/particule. La dimension de ce rayon maximal, Rmaximale, dépend du rayon de molécule d’ADN défini suivant lathéorie Flory,RF, et des dimensions de la nanoparticule, selon l’expression sui-vante Rmaximale = 2(Rpar+RF). De plus, afin de densifier la zone de travail, tout en assurant une fluctuation libre des complexes ADN/particule, le réseau de pro-téines est constitué d’une succession de surface pleine de propro-téines de dimension
dpleine 6Rmaximale, et d’aires vides de protéines. Ces ilôts de protéines sont espacés d’unedvide>Rmaximale, afin d’éviter tout enchevêtrement de ces complexes.
3.1.2 Préparation de la chambre enfermant l’échantillon
La surface servant decouvercle à notre chambre est une lame de verre percée de trous d’injections. Là encore, nous réalisons un traitement de surface pour la nettoyer, puis la traiter dans le but de la rendre suffisamment hydrophobe et limiter les collages non spécifiques.
Préparation de la lame de verre
Durant ma thèse, deux types de traitements de surface furent utilisés :
— la thiolisation : fonctionnalisation de la lame de verre avec une molécule chimique possédant la fonctionSH(thiol), puis dépôt de molécule de PEG,
l’Annexe A.1. Cette méthode assure un stockage des préparation, de l’ordre du mois, sans altérer la qualité de la répulsion stérique associée. Par contre,
66 Chapitre3. Technique expérimentale :Tethered Particle Motion (TPM)
sa réalisation nécessite deux jours de protocole. Cette méthode a été princi-palement utilisée lors du projet traitant de l’influence d’une courbure locale. — l’époxydation, comme décrit ci-dessus pour la lamelle de verre. Cette dernière méthode ne permet pas de conserver les lames fonctionnalisées comme la méthode précédentes. En revanche, sa réalisation est plus rapide, de l’ordre de la demi-journée. Cette méthode a été utilisée lors du projet traitant de l’influence de la force ionique et de la température.
Assemblage de la chambre
Pour finaliser la chambre, il suffit de rajou-ter un film de silicone d’épaisseur 0.25 mm. Ce dernier est préalablement découpé afin de laisser libre deux canaux parallèles, correspondant à un volume ∼ 10 µL chacun. Le silicone est déposé sur la lamelle de verre. Puis la lame de verre vient
refermer le tout, Fig.3.8. Fig.microfluidique fermée3.8 – Schéma de la chambre
3.1.3 Préparation des complexes ADN/particule
Notre contenant est maintenant réalisé, il est donc essentiel de préparer les objets d’intérêt que nous cherchons à étudier.
ADN
Les ADNs que nous utilisons sont produits par P. Rousseau et/ou M. Salhi, via la collaboration avec l’équipe de F. Cornet du LMGM1.
Les molécules d’ADNs sont issues d’une amplification PCR (amplification en chaîne par polymérase en : Polymerase Chain Reaction) avec des oligomères spéci-fiques ce qui permet de modifier chaque extrémité de la chaîne du polymère. D’un côté, la chaîne possède une terminaison biotinée afin de permettre l’interaction spécifique avec les streptavidines disposées sur la lamelle de verre. Tandis que l’autre côté de la chaîne possède un groupementDig, interagissant spécifiquement avec les anticorps anti-Digoxygénine2 qui recouvriront la surface des nanoparti-cules. Les interactions de type anticorps-anti-gène sont extrêmement fortes.
Au cours de ma thèse, nous avons travaillé avec différentes tailles de molécules d’ADN. Ceci nous a permis de couvrir différents régimes de comportements des polymères. La molécule la plus longue se rapproche du régime gaussien, tandis que la plus courte,L≃4Lpest plus proche du comportement d’un bâtonnet rigide.
LADN L Rg Di f f si sphère dure
bp nm nm µm.s−1
2060 ≃700 ≃108 ≃1.7
1201 ≃400 ≃82 ≃2.3
575 ≃200 ≃57 ≃3.3
1. LMGM : Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires, Toulouse-France, UMR CNRS-UPS 5100.
3.1. Principe duTethered Particle Motion (TPM) 67
Les principales tailles d’ADN que nous avons utilisées sont répertoriées dans le tableau précédent, ainsi que l’estimation de leur rayon de giration3,Eq.2.10. De plus, s’y trouve aussi le calcul de leur coefficient de diffusion en supposant que le rayon hydrodynamique Rh et le rayon de giration Rg sont à peu près égaux dans un milieu aqueux à 25◦C, Eq. 3.1. Les séquences des ADNs utilisées sont listées
en Annexe B.
Coefficient de diffusion
Dans tout environnement, toute molécule, ADN ou nanoparticule,diffuse, cela est dû au mouvement brownien. La relation de Stokes-Einsteindéfinit le coeffi-cient de diffusion Dd’une particule dans un milieu à la température T possédant un coefficient de friction ξ
Di f f = kBT
ξ Stokes-Einstein (3.1) Le coefficient de friction d’une sphère de rayonR dans un milieu de viscosité ηs’écritξ =6πηR. À température ambiante, dans de l’eauη=1.15×10−3Pa.s−1, le coefficient de diffusion d’un sphère dure de rayon R = 5 µm, rayon du noyau cellulaire, est égal à≃ 0.04µm2.s−1. Tandis qu’une sphère de R= 5 nm diffusera à la vitesse de≃40 µm2.s−1.
Les molécules du solvant diffusent. Elles entrent en collision les unes avec les autres et avec les monomères constituant le polymère. Ce phénomène entraîne des fluctuations dans les positions des objets. Tout ceci engendre aussi un changement de configuration et de conformation de l’ADN en solution. Dans le cas d’un poly-mère en pelote,Fig.1.4.1, Rest remplacé par le rayon hydrodynamiqueRh.
Nanoparticules
Pour permettre l’interaction spécifique de Dig avec l’anti-Digoxygénine, et donc l’accrochage de l’ADN aux nanoparticules, il est nécessaire de fonctionnali-serles nanoparticules avec l’anticorps. Le détail du protocole est enAnnexe A.1.
Fig. 3.9 – Anti-Digoxygènine (RCSB Protein Data Bank)
Les anti-Digoxygénine sont des molécules de taille plus importante que les streptavidines. En effet, la di-mension de ces anticorps est d’envi-ron 15 nm, Fig. 3.9. Au vu de leur taille, un phénomène d’intercalage entre les anti-Digoxygénine de