Tests intégrant des modes d’actions multiples

a. Essais in vivo

Chacun des tests in vivo lors desquels sont étudiés des paramètres relatifs à la fonction thyroïdienne présentent l’avantage d’intégrer la réponse de tous les organes, et donc potentiellement tous les modes d’actions à l’origine de la perturbation de la fonction thyroïdienne. Si les tests sur rongeur présenté précédemment sont utiles à son étude, le test de métamorphose des amphibiens a été spécifiquement mis au point pour détecter les toxiques vis-à-vis de l’axe HPT. Ce test est intégré à la batterie de tests préconisée par l’OCDE dans son cadre conceptuel pour la détection des PE.

Test de métamorphose des amphibiens (OECD TG 231).

Ce test, bien que réalisé sur amphibien et donc sur une espèce n’appartenant pas à la classe des mammifères, est considéré comme pertinent pour tous les vertébrés en raison de la grande conservation au cours de l’évolution des structures concernées. Il couvre tous les mécanismes de perturbation de la fonction thyroïdienne, puisque la métamorphose, tout comme les changements histologiques, sont des évènements apicaux. En théorie, donc, même les agonistes et antagonistes des TR peuvent être détectés par le test de

métamorphose des amphibiens puisqu’ils doivent avancer ou reculer l’âge de la métamorphose. En pratique, l’interprétation des résultats de ce test est variable selon l’examinateur. Il existe un débat d’expert qui ne parvient pas à déterminer de critère de décision universel pour décider si la substance d’essai est un THDC ou non. Pour certains, il suffit qu’un des paramètres étudiés soit altéré alors que pour d’autres, il faut obligatoirement observer une anomalie histologique dans la thyroïde pour confirmer la perturbation (Zoeller et al., 2007). L’interprétation des résultats demeure encore compliquée du fait de la sensibilité du test aux inducteurs des UDP-GT. Par exemple le phénobarbital, qui n’est pas un THDC pour l’homme, l’est pour les rongeurs en raison de l’induction des UDP-GT. Cette substance donne alors un résultat positif dans le test de métamorphose des amphibiens, alors même qu’il est connu que les hormones thyroïdiennes ne sont pas conjuguées par ces enzymes chez les amphibiens (Pickford, 2010).

Le test de métamorphose des amphibiens peut donc difficilement être utilisé seul. Il est au contraire utilisé généralement après la conduite de tests in vivo sur rongeur (male and female pubertal assays, IMRSA, enhanced repeated dose oral toxicity), lorsque ceux-ci n’ont pas fourni d’informations concluantes sur la perturbation de la fonction thyroïdienne. Il peut également être utilisé en première intention, à condition de vérifier les hypothèses soulevées au moyens de tests in vitro mécanistiques.

Essai sur eleuthero-embryons de poisson zèbre (Zebrafish Eleutheroembryo Thyroid Assay)

Après 3 jours d’exposition à la substance d’essai diluée dans l’eau, des eleuthero-

embryons de poissons zèbres sont fixés et hybridés à des anticorps polyclonaux anti-T4. Les

anticorps fixés sont ensuite révélés par des anticorps secondaires fluorescents, et une image est capturée. La fluorescence est observable sans autre préparation grâce à la transparence

des poissons. La concentration intrafolliculaire de T4 au moment de la fixation peut ensuite

être mesurée par une analyse d’image automatisée (Raldúa and Babin, 2009; Raldúa et al., 2012).

Comme pour le test de métamorphose des amphibiens, la conservation au cours de l’évolution des divers processus qui influent sur la concentration intrafolliculaire en T4

permet d’extrapoler les résutats obtenus aux mammifères, dont l’homme. Cette extrapolation souffre des mêmes limites que dans le cas des tests sur amphibiens. En outre, ce test comporte une étape de choix de l’image capturée qui dépend de l’opérateur et ajoute beaucoup de subjectivité aux résultats. Il est également coûteux en termes de main d’œuvre et nécessite de disposer d’installations propres à accueillir l’élevage de poissons.

b. Essais ex vivo

Essai sur explants de glande thyroïde de têtards de xénopes

Des glandes thyroïde sont extraites de larves de Xenopus laevis et placées dans des plaques 96 puits dans un milieu de culture contenant de la TSH pour stimuler la synthèse de T4. La T4 totale est mesurée par RIA (Radio Immuno Assay) (Hornung et al., 2010). Ce test

intègre les différents modes d’actions qui aboutissent à une perturbation de la synthèse de T4 initiée au niveau de la thyroïde. Le test nécessite 8 jours de culture pour que la T4 soit

produite en quantité suffisante pour masquer les différences initiales de quantité de T4

contenue dans les différentes glandes. Il est donc relativement lourd à mettre en place et ne se positionne pas comme du haut débit malgré la culture en plaques 96 puits. Une autre limitation concerne la détection de l’inhibition de la synthèse qui peut être rendue difficile par l’impossibilité de la différencier des conséquences d’une souffrance ou d’un stress général des glandes en culture en présence de la substance d’essai. Ce type d’essai est encore à l’état de recherche et nécessite un travail de développement avant d’imaginer sa mise en œuvre systématique.

c. Essais in vitro

T-Screen – Essai de prolifération induite par le récepteur TR activé

Le test « T-Screen » est basé sur l’induction de la prolifération cellulaire par le récepteur TR activé dans une lignée cellulaire tumorale d’hypophyse de rat, la lignée GH3, a

priori compétente pour le transport transcellulaire ou la métabolisation intracellulaire des

hormones thyroïdiennes. Ces cellules expriment le TR en grande quantité. Ce récepteur a une forte affinité pour la T3, qui l’active par sa liaison. Dans le noyau, la fixation du récepteur

sur les TRE (thyroid hormone responsive elements) entraine l’expression de nombreux gènes et parmi eux, certains sont responsables de la prolifération cellulaire (You et al., 2006). Une

augmentation ou une diminution de prolifération en comparaison avec les cellules contrôle permet ainsi d’identifier les agonistes ou les antagonistes du TR respectivement. Les composés qui agissent sur la prolifération cellulaire de façon indépendante du TR ne peuvent pas être identifiés en tant que tels et constituent des faux positifs.

8. Conclusion

Des tests sont disponibles pour tester la plupart des mécanismes à l’origine d’une perturbation de la fonction thyroïdienne. Il n’existe en revanche pas de test court terme qui intègre un nombre important de ces mécanismes, et l’approche in vitro actuellement préconisée est de réaliser un test spécifique pour chacun d’entre eux. L’approche in vivo à court terme conseillée implique quant à elle l’ajout de paramètres spécifiques à la thyroïde aux tests de criblage de la perturbation des hormones sexuelles, réalisés sur un mois, qui ont donc leur place dans des phases plus tardives du développement des molécules.

Ainsi, deux axes de recherches ont été sélectionnés pour tenter de disposer de moyens de réaliser un criblage précoce et pertinent de la perturbation de la fonction thyroïdienne :

 Evaluer la pertinence d’un criblage basé sur des études in vivo court terme chez le rat mâle et sur l’utilisation de mesures d’expression de gènes en complément des paramètres classiques utilisés en toxicologie.

 Identifier un modèle in vitro qui permette d’intégrer le criblage de plusieurs mécanismes d’action parmi ceux à prendre en compte afin de réduire la batterie de tests à réaliser.

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