Effet des hormones thyroïdiennes médié par le récepteur TR

Longtemps considérée comme marginale et peu pertinente dans le cadre de l’identification des dangers représentés par les produits chimiques, la perturbation de la signalisation dépendante du récepteur aux hormones thyroïdienne est aujourd’hui connue pour être provoquée par des composés comme les (polychlorynated biphenyls) PCBs ou les dérivés du BPA. Ce mécanisme doit par conséquent être intégré à la démarche de criblage de la perturbation de la fonction thyroïdienne.

a. Essais in vivo

Par essence, les tests in vivo intègrent les différents mécanismes de perturbation existants, et les tests de criblage décrits précédemment sont indiqués pour la détection des composés qui modifie la signalisation intracellulaire des hormones thyroïdiennes. Ces tests ne sont pas pour autant adaptés pour identifier la mise en jeu de ce mécanisme de toxicité.

b. Essais in vitro

Trois types de tests in vitro peuvent être utilisés pour le criblage de la perturbation de la signalisation intracellulaire des hormones thyroïdiennes médiée par le récepteur TR. Certains étudient la liaison des hormones à leur récepteur, d’autres étudient l’activité fonctionnelle des promoteurs qui dépendent du complexe hormone-récepteur, et les

derniers se focalisent sur les interactions entre les recepteurs et leurs co-répresseurs ou co- régulateurs, ou tout autre protéine qui module leur activité.

Tests de liaison hormone / récepteur

Ces tests évaluent la capacité des substances d’essai à modifier les propriétés de liaison des hormones thyroïdiennes au domaine de liaison du ligand situé sur le récepteur TR. Une limitation quant à l’interprétation des résultats est le fait que certains composés susceptibles d’agir sur le domaine de fixation du ligand peuvent être incapables, dans un modèle ou un autre, de pénétrer dans la poche de fixation du récepteur qui peut être différente selon le modèle étudié ou l’espèce d’intérêt.

Test d’inhibition compétitive de la liaison au TR dans les cellules MtT/E-2

Des cellules MtT/E-2 (cellules hypophysaires de rat) sont incubées en présence de

125_I-T

3 et montrent ainsi au début de l’essai un niveau de radioactivité arbitrairement

considéré à 100%. La radioactivité, mesurée à chaque addition de la substance d’essai,

décroit proportionnellement avec le degré d’inhibition de la liaison 125_I-T

3 / TR (Kitamura et

al., 2005). La viabilité des cellules est vérifiée en temps réel grâce à l’expression constitutive de la protéine GFP (green fluorescent protein) par ces cellules (une baisse de fluorescence est synonyme de mort cellulaire). Le principal inconvénient de ce test, outre l’utilisation de radioactivité, est l’impossibilité de différencier une atteinte du TRα1 d’une atteinte du TRβ1.

Test d’activité de TRα/β à l’aide de la transfection transitoire de cellules humaines

Des cellules humaines HeLa sont transfectées avec un construit d’un domaine de liaison du récepteur (Ligand Binding Domain, LBD) TR d’une espèce avec la luciférase, dont l’activité permet la quantification de la liaison de l’hormone au LBD. La méthode a été testée pour le TRα (Fini et al., 2012) et le TRβ (Sun et al., 2008). En plus de la limitation déjà évoquée concernant la stricte utilisation du LBD, la transfection transitoire est source de variabilité inter-essais.

Test bactérien de détection des ligands des récepteurs TRα et TRβ

Des bactéries Escherichia coli sont transformées avec un gène de fusion entre le LBD du récepteur TR (α ou β) et la thymidilate synthase. La liaison d’un agoniste au LBD active la thymidilate synthase et induit ainsi la croissance bactérienne, mesurée par l’absorbance optique à 600 nm (Gierach et al., 2012). La construction génétique dérive d’une méthode mise au point pour le récepteur ER. Ce test est compatible avec une utilisation à haut débit mais présente l’inconvénient d’utiliser un LBD isolé.

Test acellulaire de dissociation des hormones de leur récepteur

Les récepteurs sont d’abord liés à de la T3 radiomarquée. L’introduction d’un ligand

dans le milieu provoque la dissociation de l’hormone, ce qui peut être mesuré grâce à la radioactivité des hormones libérées (Cunha Lima et al., 2009). Outre l’utilisation de radioactivité, ce test manque de sensibilité.

Test de transactivation transcriptionnelle pour l’identification des agonistes ou antagonistes des récepteurs des hormones thyroïdiennes

Une lignée cellulaire de mammifère dont l’expression endogène des TR est très faible est transfectée avec un récepteur TRα ou TR𝛽 cloné dans un vecteur d’expression contenant un promoteur fort constitutivement actif. Un gène rapporteur, en général la luciférase, dont le promoteur est activé par le TR, est co-transfecté pour fournir une évaluation quantitative de la transactivation. Des plasmides contenant Reniella luciferase ou β-galactosidase sont également co-transfectés pour permettre la normalisation entre les réplicats et entre les essais. L’activité agoniste entraine une augmentation de l’activité luciférase, et l’activité

antagoniste peut être évaluée par une diminution de l’activité luciférase en présence de T3.

Une grande limitation de ces tests est l’absence de métabolisation qui conduit à tester la forme native des molécules, qui n’est pas forcément la forme active ni la forme majoritaire dans l’organisme en cas d’exposition environnementale. Par exemple l’exposition aux phtalates, dont certains montrent des propriétés antagonistes au TR dans les essais de transactivation, se fait majoritairement par voie orale. Ils sont alors convertis en mono- esters, forme sous laquelle ils sont absorbés. Ainsi les résultats obtenus dans les tests in vitro

avec les phtalates n’ont probablement que peu de pertinence quant à leurs effets in vivo (OECD, 2012a). Cependant, ces tests ont une bonne sensibilité et spécificité, et sont compatibles avec une utilisation à haut débit.

Test de liaison des corépresseurs et coactivateurs de TRα/β dans un système acellulaire

Les corépresseurs NCoR se lient aux TR non liés aux hormones thyroïdiennes, alors que les coactivateurs stéroïdes SRC2 se lient aux TR liés à la T3. Leur liaison stabilise le TR

dans son état de liaison à la T3. Les tests de ce type utilisent une protéine de fusion entre le

domaine LBD recombinant et la gluthation S-transferase, et les protéines NCoR et SRC2 greffées avec un fluorophore. La liaison entre les deux protéines est quantifiée par spectrofluorimétrie (Lévy-Bimbot et al., 2012). Cet essai compatible avec l’utilisation à haut débit présente l’inconvénient d’utiliser un LBD isolé.