Chapitre 4 : Synthèse et caractérisation d’inhibiteurs de β-lactamases
4.5 Tests d’inhibition de β-lactamases
4.5.1 Tests enzymatiques
Lors de tests enzymatiques, un substrat est utilisé afin d’observer sa transformation en produit par l’enzyme.
Équation 1 : Équation générale d’une réaction enzymatique
Les composés antibactériens peuvent avoir plusieurs modes d’action, ils agissent entres autres comme inhibiteur suicide (eq 2) ou inhibiteur compétitif (eq 3).
Lorsqu’on utilise un inhibiteur suicide, celui-ci provoquera une inactivation permanente de l’enzyme après avoir réagi ensemble. Dans le cas où l’on retrouve un inhibiteur compétitif, l’inhibiteur se lie à l’enzyme au site actif et empêche ainsi le substrat de s’y lier. De cette manière, le substrat et l’inhibiteur sont en compétition, le complexe enzyme/substrat est dépendant de l’activité de l’inhibiteur. Plus un inhibiteur est actif, moins on observe le complexe ES et par conséquent de produit.
Figure 65. Schéma de type Michaelis-Menten de l’inhibition compétitive83
Par ailleurs, afin de quantifier plus précisément l’activité d’un inhibiteur, une valeur d’IC50 peut être calculée. Il s’agit de mesurer l’activité d’un inhibiteur à plusieurs
concentrations pour ensuite être en mesure de calculer la concentration requise d’inhibiteur pour obtenir 50% d’inhibition du processus. Les droites obtenues de vitesse initiale à l’aide des mesures d’inhibition pour chaque concentration permettent d’obtenir la valeur IC50 d’un composé84.
4.5.2 Résultats
Ces travaux ont été réalisés au laboratoire de la Professeure Joelle Pelletier à l’Université de Montréal. Dans le cadre de nos analyses, nous avons d’abord
supposé que les sulfahydantoïnes seraient des inhibiteurs compétitifs, ce qui s’est avéré être le cas.
Le substrat utilisé dans nos tests est le Centa. L’enzyme utilisée est la TEM-1, une β-lactamase bien caractérisée. Le tampon utilisé afin de garder un pH stable lors des analyses est un tampon phosphate à pH 7. Afin d’être en mesure d’observer l’activité des sulfahydantoïnes, un blanc, c’est-à-dire un échantillon où l’inhibiteur n’était pas présent a été mesurée (100% d’activité). Cette activité est mesurée par le calcul de la quantité de produit obtenu, le produit étant le résultat de la réaction entre l’enzyme et le substrat. Ainsi, les composés n’ayant aucune activité inhibitrice donnent le même résultat que le blanc. Une diminution de la présence du produit indique donc qu’une sulfahydantoïne est active contre l’enzyme.
Centa
Une première ronde d’essais a été réalisée à l’aide de 1 mM d’inhibiteur, de 2 nM de TEM-1 et de 300 μM de Centa dans 1,5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le tampon phosphate. Il est intéressant de noter que les sulfahydantoïnes préparées sont toutes peu solubles à 1mM dans le tampon phosphate utilisé pour les tests d’activité. Ce faisant, il est possible que la concentration réelle en solution soit plus faible que 1mM.
Figure 66. Test d’inhibition de la β-lactamase TEM-1 avec les sulfahydantoïnes 98
à 103 à 1mM
Blanc 99f 99a 103c 99b 98d 101c 102b
Blanc 99d 98a 98c 103f 102a 102c 101a
Ces premiers résultats ont permis d’identifier 4 composés ayant un potentiel inhibiteur. Soit les composés 100a, 100f, 101b et 102b. Un premier essai de détermination d’IC50 a donc été réalisé avec le composé 102b (figure 67).
Malheureusement, l’IC50 n’a pu être mesuré avec précision car, à partir d’une
concentration de 2 mM d’inhibiteur, un problème de solubilité était observé, empêchant d’obtenir une courbe complète. Cependant, il est possible d’affirmer que la valeur de l’IC50 s’approche du 1 mM.
Figure 67. Essai de détermination de l’IC50 de 102b.
À la suite de ces problèmes de solubilité, des tests de solubilité des inhibiteurs dans plusieurs solvants ont été réalisés. Au préalable, il était important de tester l’impact de ces solvants sur l’activité enzymatique. Ainsi, il a été observé que le DMF et le THF à 5% inhibaient l’activité enzymatique. Finalement, le méthanol et l’acétonitrile ont permis d’observer une activité enzymatique de la TEM-1 jusqu’à une certaine concentration (figure 68), soit 30% pour le méthanol et 25% pour l’acétonitrile.
102b
80
4 nM TEM-1 - CENTA 150 µM - CAM113
0.005 0.010 0.015 0.020
One site - Fit logIC50 Best-fit values BOTTOM TOP LOGIC50 IC50 Std. Error BOTTOM TOP LOGIC50 0.0001043 0.01315 0.4354 2.725 0.001709 0.001031 0.3142 V it es se ( ab s/ m in )
Figure 68. Activité enzymatique de la TEM-1 en présence de différents
pourcentages de méthanol et d’acétonitrile.
Les tests de solubilité avec les inhibiteurs ont démontré une bonne efficacité de l’acétonitrile pour une concentration de 10% et 25% avec le méthanol. Les essais de détermination d’IC50 se sont donc poursuivis à l’aide de l’acétonitrile comme
solvant à 15%.
Malheureusement, des problèmes de solubilité ont encore été observés lors des essais à haute concentration. Malgré cela, de nouvelles analyses d’IC50 ont tout de
même été mesurées. Cependant, les valeurs n’ont pu être mesurées avec précision. À la suite de ces expériences, il est possible d’affirmer que la valeur d’IC50 pour deux composés (101b et 102b) est d’environ 1 mM (figure 69).
4 nM TEM-1 - CENTA 150 µM - CAM123 -4 -2 0 2 4 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020
One site - Fit logIC50 Best-fit values BOTTOM TOP LOGIC50 IC50 Std. Error BOTTOM TOP LOGIC50 5.790e-005 0.01396 0.2687 1.856 0.001295 0.0008078 0.1879 log CAM113 [mM] V it es se ( ab s/ m in )
Figure 69. Essai de détermination de l’IC50 de a) 102b et b) 101b
Par ailleurs, nous avons tenté de déterminer des IC50 pour les composés 100a et
100f. Par contre les analyses ont démontré une augmentation de l’activité
enzymatique. Trois essais ont été réalisés afin de vérifier les résultats, les mêmes conclusions ont été observées et seraient dues à des artéfacts expérimentaux. Nous avons donc stoppé ces études.
4.6 Conclusion
En conclusion, 21 composés analogues à la sulfahydantoïne et constituants des mîmes de la lactivicine ont été synthétisés. Suite à des tests enzymatiques, il a été démontré que les composés 101b et 102b ont bien une activité inhibitrice d’une β- lactamase (TEM-1). Des problèmes de solubilité ont été observés lors des tests, ce qui a nui à l’obtention des résultats. Ces problèmes n’ont pu être réglés en totalité, cependant des analyses IC50 ont tout de même été réalisées. Les résultats ont
4 nM TEM-1 - CENTA 150 µM - CAM113
-4 -2 0 2 4 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020
One site - Fit logIC50 Best-fit values BOTTOM TOP LOGIC50 IC50 Std. Error BOTTOM TOP LOGIC50 0.0003635 0.01716 -0.7613 0.1733 0.0007988 0.0007577 0.08702 log CAM113 [mM] V ite ss e (a bs /m in ) 102b Log 102b (mM) 101b Log 101b (mM)
permis d’affirmer que la valeur du 50% d’inhibition des composés se situe à environ 1 mM.
Même si cette activité est faible, elle constitue un résultat très encourageant. En effet, dans une première génération d’une nouvelle famille de composés, nous avons observé de l’activité anti β-lactamase, ce qui est très encourageant pour les prochaines générations d’analogues.
Les composés actifs, 101b et 102b, portent tous les deux le groupement substituant benzyle en N5 sur les sulfahydantoïnes 4-fluoro-Phe et 4-bromo-Phe respectivement (figure 70). Il serait donc souhaitable de baser la synthèse de futurs analogues sur ces motifs.
Figure 70. Structure des composés 101b et 102b
N S N O O O O OH N S N O O O O OH Br F 101b 102b
Conclusions générales
Au cours de ces travaux, nous avons montré l’utilité du motif sulfahydantoïne pour créer des composés d’intérêts thérapeutiques. Nous avons premièrement développé une nouvelle méthodologie de synthèse de peptide analogue contraint par la sulfahydantoïne. Cette méthodologie permet de substituer sélectivement la position 5 de l’hétérocycle par un acide aminé réduit. Cette modification a permis d’éliminer toute trace de racémisation et d’ouverture/déplacement du cycle dans la chaîne peptidique. Les produits sont obtenus avec une excellente pureté.
Nous avons démontré que l’insertion du motif sulfahydantoïne dans une chaîne peptidique provoque bien un changement dans la conformation de ce dernier en solution. Effectivement, des analyses par DC et RMN ont montré que les peptides contraints avaient tendance à avoir une structure mieux définie que les peptides modèles correspondant, ayant eux des structures aléatoires.
Finalement, nous avons effectué la synthèse de 21 nouveaux composés analogues de la sulfahydantoïne au potentiel antibactérien mimant des aspects de la structure de la lactivicine. Ces synthèses ont permis de mettre au point également une méthodologie de substitution sélective en position 5 du cycle par divers groupements électrophiles. De plus, des tests enzymatiques effectués sur les analogues ont bien démontré un potentiel d’inhibition des sulfahydantoïnes contre la β-lactamase TEM-1. En effet, 4 composés ont démontré une certaine activité contre cette enzyme, dont 2 démontrant un IC50 d’environ 1 mM. Bien que
très faible, ces résultats sont encourageants et permettent d’envisager la préparation d’analogues plus efficaces.
Partie expérimentale
1. Remarques générales
Les solvants et réactifs ont été traités ou purifiés de la façon suivante :
Dichlorométhane (DCM), distillé
Dichlorométhane anhydre, distillé sur CaH2
Diméthylformamide (DMF), dégazé à l’azote
Diméthylformamide anhydre, distillé sur tamis moléculaire Eau, distillée, déionisée et filtrée sur une membrane 0,45 μm Tétrahydrofurane (THF) anhydre, distillé sur Na
Acétonitrile anhydre, distillé sur CaH2
Acétone anhydre, distillé sur tamis moléculaire Diisopropyléthylamine (DIEA), distillé sur KOH Triéthylamine (TEA), distillé sur KOH
n-Propylamine, distillé sur KOH
Les solvants suivants ont été utilisés directement :
Méthanol, qualité spectroscopique Éther diéthylique, réactif ACS (BDH) Hexanes ACS
Acétate d’éthyle, réactif ACS
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton et du carbone ont été enregistrés avec un appareil Varian 400 et Varian 600. Les déplacements chimiques sont rapportés en partie par million (ppm). Le standard interne est le pic résiduel du solvant. Les abréviations suivantes ont été utilisées dans l’interprétation des spectres :
CDCl3 : Chloroforme deutéré
DMSO-d6 : Diméthylsulfoxide deutéré
δ : déplacement chimique J : constante de couplage s : singulet d : doublet t : triplet q : quadruplet dd : doublet de doublet dt : doublet de triplet m : multiplet
Les indices de rotation ont été mesurés, sur les produits purifiés seulement, à température de la pièce à l’aide d’un spectropolarimètre Jasco (73) en utilisant une cellule de quartz ayant un parcours optique de 10 cm.
Les spectres de masse (SM) ont été enregistrés sur un appareil LC-MS (MS « Time-of-flight » 6210 et LC 1200 series Agilent Technology).
Les analyses et les purifications des peptides ont été réalisées avec un appareil de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) Hewlett Packard HP 1050. Tous les éluants ont été additionnés de 0,1% d’acide trifluoroacétique.
Les études de dichroïsme circulaire ont été effectuées à l’aide d’un spectropolarimètre Jasco J-710, en utilisant des cellules cylindriques en quartz ayant des chemins optiques de 0,01 et 0,02 cm.
Les chromatographies éclairs sur colonne ont été réalisées en utilisant un gel de silice de maille 230-400 (SiliCycle) comme absorbant et une pression positive d’azote. Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des
plaques de gel de silice 0,25 mm d’épaisseur. Les composées ont été détectés à l’aide d’une exposition à la lumière ultraviolette ou aux révélateurs suivants : ninhidrine, CAM, KMnO4.
Les acides aminés ont été achetés chez Advanced Chemtech ou chez Matrix Innovation. Les autres produits sont de sources Aldrich ou VWR.
Les autres abréviations utilisées sont :
[α]D : pouvoir rotatoire éq : équivalent g : gramme h : heure L : litre M+ : ion moléculaire min : minute mol : mole Pf : point de fusion Rdt : rendement Rt : temps de rétention sec : seconde t.p. : température de la pièce
2. Synthèses
2.1 Synthèse du motif sulfahydantoïne
2.1.1 Procédure générale pour l’estérification de l’acide aminé
Le méthanol (100mL) est amené à 0˚C et le chlorure de thionyle est ensuite ajouté au méthanol goutte à goutte. L’acide aminé peut ensuite être ajouté. La solution est chauffée à reflux pendant deux heures puis évaporée à sec. Le produit est lavé à l’éther dans un Büchner et séché dans un dessiccateur sous vide avec P2O5.
Hydrochlorure de (S)-phénylalaninate de méthyle (62)
C10H14NO2
RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,77 (s, 3H, NH); 7,31-7,19 (m, 5H, arom.); 4,19-4,16
(m, 1H, CHα); 3,60 (s, 3H, OCH3); 3,21-3,04 (m, 1H, CH2Ph)
RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 170; 135,4; 130,1; 129,3; 17,9; 53,9; 53,2; 36,5
HRMS-ESI calculé pour C10H14NO2 [M+H]+ 180,2237, trouvé 180,2340
2.1.2 Procédure générale pour la réaction avec le CSI/t-BuOH
L’acide aminé estérifié est placé dans le dichlorométhane anhydre (50mL) à 0˚C et la triéthylamine est ajoutée goutte à goutte. Simultanément, le CSI est également placé dans le CH2Cl2 à 0˚C dans un second ballon où le tert-butanol y est ajouté
goutte à goutte. Le contenu du second ballon est ajouté au premier en même temps que la triétylamine. Après 1 heure d’agitation à t.p., la réaction est arrêtée avec une solution de HCl 0,5 N (10mL). La phase organique est lavée avec HCl 0,5 N (2 x 20mL) et de l’eau (2 x 20mL). La phase organique est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée.
(S)-N-(N-tertiobutyloxycarbonyl)sulfamoylphénylalaninate de méthyle (63)
C15H22N2O6S
RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 10,87 (s, 1H, NH); 8,32 (d, 1H, NH); 7,25-7,14 (m, 5H,
arom.); 4,11 (d, 1H, CHα); 3,48 (s, 3H, CH3); 2,89 (m, 2H, CH2); 1,34 (s, 9H, BOC)
RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 172,2; 151,1; 137,3; 129,8; 128,9, 127,3; 81,8; 28,4
HRMS-ESI calculé pour C15H22N2O6S [M+H]+ 358,4101, trouvé 359,0303
2.1.3 Procédure générale pour la réaction de Mitsunobu
L’acide aminé sulfamoylé, la triphénylphosphine et l’alcool allylique sont dissous dans un minimum de THF. Le DIAD est ajouté goutte à goutte puis la solution est agitée 2 heures. La réaction est évaporée puis co-évaporée à l’éther. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : 70 hexanes/ 20 acétate d’éthyle à 60 hexanes/ 40 acétate d’éthyle).
(S)-(N-allyl, N-tertiobutyloxycarbonyl)sulfamoylphénylalaninate de méthyle (64)
C18H26N2O6S RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,28-7,15 (m, 5H, arom.); 5,76 (d, 2H, CH2); 5,24 (m, 2H, CH2); 4,34 (d, 1H, CHα); 4,19 (d, 2H, CH2); 3,68 (s, 3H, CH3); 3,10 (t, 2H, CH2Ph); 1,47 (s, 9H, BOC) RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 173,2; 156,8; 137,6; 135,2; 130,0; 128,8; 127,3; 117,1; 116,6; 68,5; 57,6; 52,4; 21,3
HRMS-ESI calculé pour C18H26N2O6S [M+H]+ 398,4739, trouvé 398,5937
2.1.4 Procédure générale pour la cyclisation
La déprotection du sulfamide est d’abord réalisée. Le produit est dissous dans CH2Cl2 (100mL). La solution est amenée à 0˚C et une solution de 50% TFA/
CH2Cl2 (100mL) y est ajoutée puis le milieu réactionnel est agité 2 heures à t.p.. La
solution est évaporée et purifiée par chromatographie éclair sur silice, (60 hexanes/ 40 acétate d’éthyle). Puis, le produit récupéré est dissous dans du
méthanol (150mL). Le méthanoate de sodium est ajouté et la réaction est portée à reflux pour 1h. À ce moment, du méthanoate de sodium est de nouveau ajouté et le reflux est poursuivi pour 30 minutes. Le milieu réactionnel est amené à 0˚C, le pH est ramené à 2-3 avec HCl concentré et la solution est évaporée. Le produit est dilué dans le CH2Cl2 (100mL), lavé avec de l’eau (2 x 75mL). La phase organique
est séchée sur Na2SO4, filtrée et évaporée. Le produit est purifié par colonne
chromatographique sur colonne de gel de silice (70 hexanes/ 30 acétate d’éthyle à 50 hexanes/ 50 acétate d’éthyle).
1,1-Dioxide de 2-allyl-4S-benzyl-1,2,5-thiadiazolidin-3-one (70) C12H14N2O3S RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,37-7,22 (m, 5H, arom.); 5,80 (m, 1H, CH); 5,29 (t, 2H, CH2); 4,99 (s, 1H, NH); 4,39 (s, 1H, CHα); 4,17 (d, 2H, CH2); 3,31-3,08 (m, 2H, CH2Ph) RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 171,8; 165,7; 156,2; 135,1; 119,8; 77,7; 67,0; 60,6; 48,2; 43,1; 40,2; 28,6
HRMS-ESI calculé pour C12H14N2O3S [M+H]+ 266,3162, trouvé 265,0602
2.2 Synthèse d’électrophiles
2.2.1 Procédure générale pour la réduction d’un acide aminé
L’acide aminé (8 mmol) est dissous dans un minimum de THF anhydre. La solution est portée à 0°C puis le BH3/THF (18 mmol) est ajouté goutte à goutte pendant
une heure. Le mélange réactionnel est par la suite agité une heure et demie supplémentaire à t.p.. La réaction est arrêtée à l’aide de HCl concentré à 0°C puis le solvant évaporé sous vide. Le produit est extrait à l’aide de l’éther (3 x 25mL) et lavé à l’aide de NaHCO3 saturé (3 x 50mL) et saumure (1 x 25mL). Le produit est
BOC-phénylalaninol (66)
C14H21NO3
RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,31-7,23 (m, 5H, arom.); 4,81 (d, 1H, NH); 4,05 (s,
1H, CHα); 3,54 (d, 2H, CH2Ph); 1,44 (s, 9H, BOC)
RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 137,3; 129,5; 128,9; 127,1; 51,7; 39,1; 37,7; 28,6
HRMS-ESI calculé pour C14H21NO3 [M+H]+ 251,3215, trouvé 252,6723
2.2.2 Bromation
L’acide aminé réduit (1 mmol) et la triphénylphosphine (0,8 mmol) sont dissous dans un minimum de THF anhydre. La solution est amenée à 0°C et le N-Br succinimide est ajouté (1 mmol). La réaction est agitée toute la nuit puis arrêtée à l’aide de Na2S2O3 (5mL). Le THF est évaporé puis le produit est extrait avec de
l’acétate d’éthyle (2 x 30mL). La phase organique est lavée avec une solution NaOH 1N (2 x 50mL) puis une solution aqueuse saturée de NaCl (1 x 30mL). Le produit est séché sur Na2SO4 et évaporé.
N-BOC-2-bromo-1-aminophényl (67) C14H20BrNO2
RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,31-7,23 (m, 5H, arom.); 4,81 (d, 1H, NH); 4,05 (s,
1H, CHα); 3,54 (d, 2H, CH2Ph); 2,93-2,85 (m, 2H, CH2Br); 1,44 (s, 9H, BOC)
RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 137,3; 129,5; 128,9; 127,1; 51,7; 39,1; 37,7; 28,6
HRMS-ESI calculé pour C14H20BrNO2 [M+H]+ 314,2181, trouvé 314,5991
2.2.3 Réaction avec chlorure de mésyle (68)
L’acide aminé réduit (1 mmol) et la triéthylamine (1,2 mmol) sont dissous dans un minimum de THF anhydre. Le chlorure de méthanesulfonyle (1,2 mmol) est dissous dans du THF (3mL) puis ajouté goutte à goutte au premier mélange. La réaction est agitée pendant 4 heures. Ensuite, le mélange est déposé dans un bain de glace où le produit précipite. Finalement, le produit est filtré et purifié par
chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : 80 hexanes/ 20 acétate d’éthyle à 60 hexanes/ 40 acétate d’éthyle).
N-BOC-1-aminophenyl-2-mésylate (68) C15H23NO5S RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,31-7,21 (m, 5H, arom.); 4,81 (d, 1H, NH); 4,23 (s, 1H, CHα); 3,62 (d, 2H, CH2Ph); 2,86 (m, 2H, CH2OMs); 2,42 (s, 3H, CH3); 1,39 (s, 9H, BOC) RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 139,0; 129,1; 128,6; 126,5; 51,8; 39,0; 35,9; 27,1
HRMS-ESI calculé pour C15H23NO5S [M+H]+ 329,4119, trouvé 329,2091
2.2.4 Réaction avec I2 (69)
La triphénylphosphine (0,6 mmol) est dissoute dans un minimum de CH2Cl2 et la
solution est mise à 0°C. L’iode (0,5 mmol) et l’imidazole (0,2 mmol) sont ajoutés à la solution. Celle-ci est chauffée pour quelques minutes puis laissée lentement refroidir. Ensuite, l’acide aminé réduit ( 0,250 mmol) est dissous dans un minimum de CH2Cl2 et est ajouté goutte à goutte au milieu réactionnel. La réaction est alors
chauffée à reflux pendant 2 heures. Une fois la solution refroidie, elle est lavée avec Na2SO3 (2 x 50mL) et de l’eau (1 x 50mL), séchée sur Na2SO4 et évaporée.
Finalement, le produit est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : 60 hexanes/ 40 acétate d’éthyle) suivi d’une recristallisation à chaud dans l’hexane. N-BOC-2-iodo-1-aminophényl (69) C14H20INO2 RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,33-7,22 (m, 5H, arom.); 4,87 (d, 1H, NH); 4,11 (s, 1H, CHα); 3,59 (d, 2H, CH2Ph); 2,90-2,84 (m, 2H, CH2I); 1,34 (s, 9H, BOC) RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 138,2; 129,8; 127,8; 127,0; 51,0; 39,5; 36,6; 27,1
2.3 Synthèse sur support solide
2.3.1 Procédure générale pour la fixation du premier acide aminé
La résine oxime (10,0g) ayant un taux de substitution théorique de 0,3 mmol/g est placée dans une ampoule munie d’un verre fritté à une extrémité et d’un bouchon en téflon à l’autre. La résine est d’abord gonflée au CH2Cl2 (75mL) et ensuite lavée
deux fois avec le même solvant (2 x 75mL). Dans un ballon, la BOC-Xaa-OH (25 mmol) est dissoute dans le CH2Cl2 (50mL) puis la solution est amenée à 0°C. Du
DCC (25 mmol) et du DMAP (0,5 mmol) sont additionnés à cette solution et le mélange est agité pendant 30 minutes à 0 °C. Ensuite, le mélange est ajouté à l’ampoule en même temps que la DIEA (20 mmol). L’ampoule est mise sous agitation mécanique pendant 3 heures. Par la suite, le contenu de l’ampoule est filtré par succion et la résine est lavée successivement à l’aide des solvants suivants : DMF (3 x 100mL), MeOH (3 x 100mL), DMF (3 x 100mL), MeOH (4 x 100mL). La résine est séchée sous vide.
2.3.2 Détermination du taux de substitution
Un test de Kaiser à la ninhydrine70 a été utilisé pour déterminer le taux de substitution. Les taux obtenus varient entre 0,3 et 0,6 mmol/g de résine sèche.
2.3.3 Acétylation des sites non-substitués
La résine est préalablement gonflée au DMF (2 x 100mL). Puis, un mélange d’anhydride acétique/DMF 1/1 (50mL) et de la DIEA (12 mmol) est ajoutée à l’ampoule. Celle-ci est mise sous agitation mécanique pendant 30 minutes. Ensuite, le contenu de l’ampoule est filtré par succion et lavé successivement avec les solvants suivants : DMF (3 x 100mL), MeOH (3 x 100mL), DMF (3 x 100mL), MeOH (4 x 100mL). La résine est séchée sous vide.
2.3.4 Procédure générale pour le couplage d’un acide aminé
La résine est d’abord gonflée au CH2Cl2 (2 x 100mL) et ensuite lavée deux fois
avec le même solvant ( 2 x 75mL). Une solution de TFA/CH2Cl2 50 : 50 (200mL)
est ajoutée à l’ampoule et le mélange est agité mécaniquement pendant 30 minutes. Ensuite, le contenu de l’ampoule est filtré par succion et la résine est lavée à l’aide des solvants suivants : DMF (3 x 100mL), MeOH (3 x 100mL), DMF (3 x 100mL).
Dans un ballon, la BOC-Xaa-OH (25 mmol) est dissoute dans le CH2Cl2 (50mL)
puis la solution est amenée à 0°C. Du HBTU (1 mmol), du HOBt (1 mmol) sont additionnés à cette solution et le mélange est agité pendant 30 minutes à 0°C. Ensuite, le mélange est ajouté à l’ampoule en même temps que la DIEA (0,8 mmol). L’ampoule est mise sous agitation mécanique pendant 2 heures. Par la suite, le contenu de l’ampoule est filtré par succion et la résine est lavée successivement à l’aide des solvants suivants : DMF (3 x 100mL), MeOH (3 x 100mL), DMF (3 x 100mL), MeOH (4 x 100mL). La résine est séchée sous vide.
2.4 Synthèse d’un peptide analogue contraint
2.4.1 Substitution à la position N5 de la sulfahydantoïne
La sulfahydantoïne (1,0g, 3,8 mmol) est dissoute dans l’acétonitrile anhydre (20mL) et la solution est amenée à 0°C. Le carbonate de césium (24g, 75 mmol) est ajouté puis le 2-(Boc-amino)éthylbromide (2,524g, 11,26 mmol) dissous dans 5mL d’acétonitrile anhydre est additionné sur 24 à 48 heures à l’aide d’un pousse seringue. La solution est agitée quelques heures après la fin de l’addition. La réaction est évaporée.
1,1-Dioxide de 2-allyl-4S-benzyl-5-tert-butyl N-ethyl carbamate-1,2,5-thiadiazolidin- 3-one (72) C12H14N2O3S RMN1H (CDCl3, 400 MHz) δ 7,28-7,24 (m, 5H, arom.); 5,74 (m, 1H, CH); 5,22 (m, 2H, CH2); 4,63 (s, 1H, CHα); 4,18 (d, 2H, CH2); 3,39 (s, 2H, CH2); 3,10 (m, 4H, CH2Ph et CH2); 1,43 (s, 9H, BOC) RMN13C (CDCl3, 100 MHz) δ 167,9; 135,1; 128,9; 120,3; 77,4; 61,9; 43,5; 37,1;
HRMS-ESI calculé pour C12H14N2O3S [M+H]+ 266,3162, trouvé 266,1624
2.4.2 Procédure générale pour la substitution à la position N5 des sulfahydantoïnes antibactériennes
L’analogue sulfahydanoïne est dissout dans l’acétone anhydre et la solution est portée à 0°C. Le K2CO3 et le nucléophile sont ajoutés à la solution puis la réaction
est agitée pendant 1 heure 30 minutes. Ensuite, le mélange est évaporé et le produit est dissous dans du CH2Cl2. Le mélange est lavé avec de l’eau (2 x 50mL),
séché sur Na2SO4, puis évaporé. Le produit est purifié par chromatographie sur
colonne de gel de silice.
2.4.3 Procédure générale pour l’ozonolyse
L’analogue sulfahydantoïne (0,5 mmol) est dissous dans un mélange DCM/méthanol 90/10 et la solution est amenée à -78°C. L’ozone est bullé dans le mélange réactionnel. La réaction est suivie par ccm et une fois l’apparition d’une coloration bleue, le courant d’ozone est retiré. Un courant d’azote est mis dans le mélange réactionnel pour 15 minutes pour ensuite traiter le mélange au sulfure de diméthyle (DMS) (1,384g, 22,27 mmol) pour la nuit. Puis, on refait passer un courant d’azote pour un autre 15 minutes. Le mélange réactionnel est évaporé puis le produit est redissous dans du DMF (5,5mL, 22,16 mmol). L’oxone (0,852g, 1,385 mmol) est ajouté à la réaction et celle-ci est suivie par MS. Le mélange réactionnel est agité à t.p. jusqu’à complétion de la réaction. Une fois la réaction
terminée, le produit est extrait avec l’acétate d’éthyle. La phase organique est ensuite lavée avec HCl 1N puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. La