Chapitre 5 Culture et détection de P aeruginosa avec l’électrode 3D de PEDOT:PSS
5.6. Protocoles de microbiologie du Chapitre 5
5.6.1. Tests de bactério-compatibilité sur boites
5.6.3. Evaluation de la croissance bactrienne dans la phase liquide intrapore ... 192 5.6.4. Analyse de surnageants in situ ... 192
5.1. Contextes de l’étude microbiologique
Les chapitres précédents ont permis de caractériser d’un point de vue redox le surnageant de culture bactérienne, ainsi que de mettre au point des él ectrodes permettant d’amplifier le si- gnal. Ce chapitre est consacré aux expériences utilisant l’électrode 3D de PEDOT:PSS pour la caractérisation in situ de surnageants de culture bactérienne via la croissance de bactéries dans la structure. Il présente tout d’abord des caractérisations réalisées pour répondre au volet physiolo- gique du cahier des charges du Chapitre 4 et la mise au point de la culture dans le PEDOT:PSS. Puis, suivront les adaptations réalisées sur la puce pour permettre une utilisation en m icrobiologie ainsi que les premiers résultats d’analyse de surnageant in situ.
Toutes les expériences présentées ici ont été réalisées en premier lieu sur des microor- ganismes de classe 1. La classe 1 regroupe les micro -organismes qui n’ont jamais été décrits comme pathogènes pour l’homme et qui ne présentent pas de menace pour l’environnement. Ils sont manipulés dans des laboratoires de niveau L1. Pseudomonas aeruginosa (PA) appartient à
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la classe 2, en tant que bactérie pathogène mais pour laquelle des tra itements efficaces sont con- nus. Elle doit être manipulée dans des laboratoires de niveau L2, dans lequel est mis en œuvre un confinement de niveau 2 pour protéger le personnel ainsi que prévenir une dissémination dans l’environnement. Il est d’usage de tester de nouveaux protocoles expérimentaux dans des labora- toires L1 avant de les transposer en L2.
5.2. Caractérisations physiologiques de l’électrode
Le volet physiologique du cahier des charges du Chapitre 4 concernait la stérilisation, la biocompatibilité et la porosité du matériau. Ce paragraphe passe en revue ces différentes carac- téristiques testées avec des bactéries de classe 1.
5.2.1. Préparation et stérilisation
Avant la stérilisation des électrodes, une étape d’immersion pendant 24h dans de l’eau déionisée (DI) est effectuée. Son but est d’éliminer les molécules provenant de la dispersion com- merciale initiale ou des additifs qui seraient mal immobilisés dans la structure. Cette étape a été introduite après des retours d’expériences de culture de cellules eu caryotes sur des films de PEDOT:PSS (formulation du Chapitre 3) dans le laboratoire de Bioélectronique de l’Ecole des Mines de Saint-Etienne. Son influence est étudiée dans le paragraphe 5.2.2.2.
Pour la stérilisation des électrodes 3D, nous avons choisi d’utiliser une stérilisation à la vapeur réalisée avec un autoclave. Elle peut être accomplie sur des électrodes soit séchées, soit immergées (dans l’eau DI ou un milieu de culture). Dans un premier temps, la stérilisation à sec (donc après séchage de la structure immergée 24h dans l’eau DI) a été choisie, dans le but d ’hy- drater les électrodes directement avec le milieu de culture inoculé et d’ainsi permettre une col o- nisation de l’intérieure de la mousse plus facilement.
D’un point de vue morphologique, ces 2 étapes de préparation et stérilisation ne modi- fient pas l’électrode. Concernant la conductivité, des mesures ont été effectuées après chaque étape pour la composition PG3.5D0.5. Les résultats (Tableau 5-1) montrent que la résistivité de contact reste constante au cours du processus. Pour sa part, la conductivité s’améliore légèrement mais les changements dépassent peu ceux de l’erreur de mesur e du Chapitre 4. La stérilisation par autoclave est donc considérée comme adaptée à notre matériau sur la base des résultats mor- phologiques et électriques. Toutefois, une différence de mouillabilité des électrodes a été remar- quée après l’étape d’immersion dans l’eau DI : l’électrode devient plus hydrophobe et la réhydra- tation est compliquée. Cela est probablement une conséquence du relargage partielle de la DBSA en solution pointé par la diminution de la conductivité dans le Chapitre 4, paragraphe 4.5.5.3. Pour contourner ce problème, la stérilisation est depuis réalisée sur des électrodes immergées. Le matériau n’est donc plus séché avant utilisation. La colonisation devra donc se faire par diffusion des bactéries dans un matériau déjà mouillé.
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5.2.2. Bactério-compatibilité
Deux types de tests de bactério-compatibilité ont été effectués : le premier sur boite de Petri pour évaluer la toxicité du matériau par contact direct avec des colonies, et le second en milieu liquide pour évaluer l’impact du relargage de molécules par le matériau sur les bactéries.
5.2.2.1. Tests sur boite
Tout d’abord, des tests similaires à l’antibiogramme de Kirby-Bauer [177] (i.e. par dif- fusion en milieu gélosé) ont été effectués sur un panel de microorganismes de classe 1, pour s’assurer de l’absence de toxicité directe du matériau. Plusieurs microorganismes très différents les uns des autres ont été testés pour vérifier la biocompatibilité de nos structures à base de PEDOT sur des espèces présentant des caractéristiques (et notamment la composition de leur membrane) variées. Ces tests consistent à ensemencer de manière homogène la surface de boites de Petri (réalisation d’un tapis bactérien) et à observer si la croissance des microorganismes est inhibée, ou non, à proximité du matériau à tester, ce dernier étant simplement posé sur le tapis microbien. L’observation d’un disque d’inhibition serait la conséquence du relargage de subs- tance(s) toxique(s) par le matériau. Le protocole du test est présenté en détails dans le paragraphe 5.6.1. Les microorganismes testés dans cette expérience sont les suivants :
· Des bactéries Gram -, comme la bactérie d’intérêt PA : o Citrobacter freundii ATCC 8090
o Enterobacter cloacae ATCC 13047 o Escherichia coli ATCC 25922 · Des bactéries Gram + :
o Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 o Staphylococcus xylosus ATCC 700404 · Une levure (eucaryote unicellulaire) :
o Candida albicans ATCC 14053
Aucun disque d’inhibition n’est visible au cours de la culture pour les 9 microorganismes testés. Ce résultat est très positif et atteste de l’absence de relargage massif de substances toxiques par les structures 3D. Toutefois, ce test facile à mettre en place, ne permet pas de s’assurer de l’absence complète de ralentissement de la croissance bactérienne, notamment dans les premières heures de la culture.
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Figure 5-1 : Exemple de résultat du test de type Kirby-Bauer après 72h d’incubation.
5.2.2.2. Tests en liquide
Pour évaluer plus complétement la bactério-compatibilité des électrodes de PEDOT:PSS, et mettre en évidence un éventuel ralentissement de croissance bactérienne, un se- cond test a été réalisé en phase liquide. Il a été effectué avec la souche de classe 1 Pseudomonas
Putida (PP) ATCC 31483. Cette souche a été choisie plutôt que les autres souches de classe 1
utilisées dans le paragraphe précédent car elle est du genre Pseudomonas comme PA, et donc de nature proche.
Ce test vise à comparer la croissance bactérienne pour 4 cultures. Son protocole détaillé est donné dans le paragraphe 5.6.2. Les 4 cultures sont :
· Culture témoin : les bactéries sont simplement inoculées dans du milieu de culture LB. La croissance des bactéries dans cette culture sera la croissance de référence dans cette expérience.
· Culture « 3D autoclave » : les bactéries sont inoculées dans du milieu de culture LB, dans lequel est ajouté une structure de PG3D0.75 qui n’a pas connu l’étape de dé- gorgement dans l’eau DI, et qui a été stérilisée à sec. Cette culture permet d’évaluer l’influence de notre protocole de préparation/stérilisation sur la c roissance bacté- rienne.
· Culture « 3D immersion eau DI + autoclave » : les bactéries sont inoculées dans du milieu de culture LB, dans lequel est ajouté une structure de PG3D0.75 qui a été immergée pendant 14 jours dans de l’eau DI, et qui a été stérilisée dedans. Cette culture permet d’évaluer l’impact de notre protocole de préparation/stérilisation sur la croissance bactérienne.
· Culture « 3D immersion LB + autoclave » : les bactéries sont inoculées dans du mi- lieu de culture LB, dans lequel est ajouté une structure de PG3D0.75 qu i a été im-
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de spectrophotomètre. Du milieu LB non inoculé du même lot est utilisé comme référence pour déterminer la densité optique. Cette référence est renouvelée toutes les heures et le zé ro est ef- fectué avant chaque série de mesures.
La population bactérienne suit la loi suivante lors de la phase de croissance exponen- tielle :
ܰሺݐሻ ൌ ܰʹ௧Ȁఛ
avec ܰሺݐሻ le nombre de bactéries à l’instant ݐ, ܰ le nombre de bactéries lors de l’inoculation et ߬
le temps nécessaire pour le doublement de la population bactérienne (appelé temps de généra- tion).
En traçant le logarithme de la DO580 en fonction du temps de culture, une droite est
obtenue lors de la phase exponentielle dont la pente ܽ est reliée à ߬ selon la formule suivante : ܽ ൌ݈݊ሺʹሻ߬
La DO580 mesurée est très proche sur l’ensemble de l’expérience pour les 4 flacons ( Fi-
gure 5-2). La phase exponentielle est atteinte entre les mesures à 246 et 355min. Une régression linéaire a été effectuée entre ces valeurs afin de déterminer le temps de génération ߬.
Figure 5-2 : Evolution de logarithme de la densité optique en fonction du temps de cul- ture pour l’expérience de bactério-compatibilité en phase liquide.
Les temps de génération ߬ sont proches de celui du témoin (28,6min) pour les 3 expé- riences avec la structure 3D (Tableau 5-2) : entre 28,8 et 32,5 min. Il n’y a donc pas de différences significatives entre tous ces temps de génération. Cela signifie que la présence de structure 3D dans le liquide ne semble pas ralentir la croissance, que la structure ait subi ou non l’étape d’im- mersion avant stérilisation et que cette étape soit réalisée dans de l’eau DI ou dans du LB. A la vue de ces résultats, il semble que l’immersion dans de l’eau DI ou dans du LB ne soit pas utile pour préserver la croissance bactérienne. Cette étape pourrait à priori être supprimée et la struc- ture 3D pourrait être utilisée après simple stérilisation à sec à l’autoclave. Toutefois, nous avons choisi de garder l’étape d’immersion dans notre protocole par prudence, ne pouvant être sûr que ce résultat réalisé sur PP soit bien aussi valable sur PA.
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Tableau 5-2 : Temps de génération de l’expérience de bactério -compatibilité en phase liquide.
Flacon Temps de génération en phase exponentielle (min)
Témoin 28,6
3D autoclave 32,5
3D immersion eau DI + autoclave 32,0 3D immersion LB + autoclave 28,8
5.2.3. Croissance bactérienne au sein des électrodes
L’étape suivante est la caractérisation de la croissance bactérienne au sein des structures 3D. Deux méthodes ont été mises en place, l’une permet d’accéder aux bactéries présentes dans l’ensemble du matériau et l’autre aux bactéries à la surface des pores.
5.2.3.1. Evaluation de la croissance bactérienne dans le matériau
Peu de méthodes existent dans la littérature pour évaluer la croissance bactérienne à l’intérieur d’une matrice. Nous avons donc dû développer notre propre méthode. Cette méthode est adaptée des tests bactériens de l’industrie agroalimentaire. Ces tests consistent à placer un échantillon de nourriture dans un sachet auquel est ajouté du milieu de culture. Le sachet est ensuite introduit dans un broyeur homogénéisateur (appelé « stomacher ») dans lequel il est pé- riodiquement frapper par des pales pour réduire en bouillie l’échantillon. Ainsi, les bactéries se détachent de la matrice alimentaire et passent dans le milieu de culture. Ce dernier est ensuite analysé par des méthodes classiques.
Dans notre cas, nous avons procédé de la même façon en utilisant comme échantillon une structure 3D immergée pendant différentes durées dans une culture liquide de PP ATCC 31483. La Figure 5-3 schématise cette expérience. Après broyage de la structure 3D, une fraction du milieu de culture du sachet est étalée à la surface des boites de Pétri. Chaque bactérie vivante va devenir une colonie. Ces colonies sont ensuite comptées après 24h d’incubation à 37°C. Le résultat du comptage est donné en unité formant colonie (CFU pour colony-forming unit). Il per- met de remonter à la concentration de bactéries dans la structure 3D au moment du prélèvement. Pour remonter à cette concentration, il a été considéré que le volume accessible aux bactéries dans la structure 3D est le même volume que celui accessible à l’eau DI dans le Chapitre 4 lors de l’expérience de pesage (1034µL de milieu de culture par mL de dispersion lyophilisée). No us faisons donc l’approximation qu’il n’y a pas de pores trop petits pour les bactéries, et qu’elles colonisent l’ensemble de la structure 3D.
A chaque prélèvement de structure 3D dans le milieu de culture de PP, une partie du milieu de culture est aussi prélevée pour effectuer un comptage des bactéries hors de la structure
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Figure 5-3 : Représentation schématique des étapes de l’expérience de mesure de la croissance bactérienne intra-pore.
Le même ordre de grandeur est trouvé concernant le nombre de bactéries dans la struc- ture et dans le milieu de culture : plus de 107 CFU/mL pour les 4 durées de culture testées (Tableau
5-3). La culture dans la structure est donc possible à un rythme comparable à celui dans le liquide. Toutefois, pour chaque temps de culture, moins de bactéries sont comptées dans la structure 3D que dans le liquide (par exemple, après 473min de culture, il y a 4,60*107CFU/mL dans le liquide
contre 3,25*107CFU/mL dans la structure). Mais, nos valeurs sont probablement entachées d’une
grande erreur de mesure comme l’atteste les valeurs identiques trouvées à 394 et 436min concer- nant la concentration bactérienne dans la structure 3D. Cette grande erreur peut venir du fait que le broyage de la structure n’extrait probablement pas toutes les bactéries de l’échantillon solide, cette technique étant initialement utilisée sur des aliments et non des matrices polymériques arti- ficielles. On ne peut pas conclure de manière quantitative sur cette expérience mais seulem ent de manière qualitative. La croissance bactérienne a bien lieu dans la structure 3D à un rythme peu différent de celui observé dans la phase liquide.
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Tableau 5-3 : Nombre de bactéries dans le liquide à l’extérieur et à l’intérieur de la structure 3D.
Temps de culture (min)
Bactéries dans le milieu (107 CFU/mL)
Bactéries dans la structure 3D (107 CFU/mL)
330 2,44 1,91
394 4,15 2,73
436 4,42 2,73
473 4,60 3,25
5.2.3.2. Bactéries en contact avec le PEDOT:PSS
Une structure 3D ayant été placée dans un milieu de culture de PP de la même manière que pour l’expérience précédente, est retirée du milieu après 18h de culture (1080 min). Le pro- tocole de fixation/déshydratation ci-dessous lui est appliqué dans le but d’effectuer des observa- tions MEB de la surface des pores. Ce protocole est adapté de celui communément utilisé pour l’observation MEB d’échantillons biologiques [178], [179]. Il consiste en une étape de fixation visant à tuer les bactéries, et en plusieurs étapes de déshydr atation visant à éliminer l’eau pour éviter une explosion des bactéries lors de la mise sous vide du MEB.
· Fixation des bactéries dans du glutaraldéhyde 2,5% dilué dans du PBS pendant 15min à température ambiante,
· Rinçage 3 fois avec du PBS froid,
· Immersion dans des mélanges éthanol/eau DI à divers ratios pendant 15-20min pour chacune de teneurs en éthanol suivante : 50, 60, 70, 80, 90, 100 et 100%,
· Immersion dans de l’acétone pendant 20-30min, · Séchage à l’air libre puis découpe au scalpel.
Pour obtenir de meilleures images MEB, une métallisation au platine est effectuée avant observation. Quelques bactéries sont observées sur les parois de la structure de PG3.5D0.5 ( Fi- gure 5-4). L’aspect extérieur des bactéries n’est pas identique pour toutes les observations : par- fois les membranes observées semblent intactes ( Figure 5-4a), parfois elles ne sont pas lisses et les bactéries sont contractées (Figure 5-4b). Cela est probablement dû au protocole de fixation qui n’est pas optimisé et qui peut abîmer les membranes. Pour les bactéries intactes, leur morpho- logie est celle attendue pour des bactéries se développant normalement, ce qui est positif.
Il est intéressant de noter que les parois du matériau ne sont pas recouvertes de bactéries : seulement quelques-unes sont observées. Ce résultat montre que la majorité des bactéries restent en phase liquide dans le surnageant au cours de la culture, les b actéries ne présentent pas une affinité forte avec notre électrode de PEDOT. Ce résultats est cohérent avec le résultat des travaux de Bouguelia [180] qui montrent que très peu de bactéries s’attachent à un autre polymère con-
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a. Ǥ
Figure 5-4 : Image MEB de Pseudomonas putida à la surface de PG3.5D0.5.
5.3. Adaptation de la puce pour les mesures en laboratoire de microbiologie
5.3.1. Structure de la puce
Les modèles de puces développées dans le Chapitre 4 ne conviennent pas pour les me- sures in situ. En effet, une électrode de référence et une contre électrode sont immergées dans la cuve de la puce qui est donc ouverte. Les mesures in situ auront lieu à 37°C, pendant plusieurs heures et sous agitation. Il faut donc avoir une puce qui puisse être fermée pendant la cultur e. J’ai donc imaginé une puce possédant 3 puits (Figure 5-5) : l’un pour l’électrode de travail, le 2e pour
la référence et le 3e pour la contre-électrode. De plus, la cuve de l’électrolyte est dimensionnée
pour être compatible avec un cadre collant double face couramment utilisé pour définir une cuve entre lame de verre et lamelle en biologie. Ce cadre autocollant est étanche et neutre biologique- ment, il permettra donc de fermer la cuve après inoculation.
Figure 5-5 : Puce pour les mesures électrochimiques in situ.
5.3.2. Contre-électrode
La contre-électrode utilisée habituellement est un carré de platine. Pour l’intégrer da ns la puce, une autre stratégie a été choisie : réaliser une contre électrode du même matériau que l’électrode de travail. Ainsi, pour s’assurer que la contre électrode ne sera pas limitante pour le passage du courant, il suffit de choisir un volume plus grand que celui de l’électrode de travail.
5.3.3. Electrode de référence
L’électrode de référence utilisée jusqu’à présent est une électrode Ag/AgCl combinant une partie solide et un électrolyte. Pour miniaturiser ce type d’électrode, il est plus facile de ne pas utiliser d’électrolyte. En effet, son utilisation nécessite de mettre en place une membrane retenant les ions pour éviter leur diffusion dans la solution. Dans le cas d’une électrode Ag/AgCl,
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une alternative souvent choisie pour intégrer l’électrode de référence est de chlorer une surface d’argent. Toutefois, les ions Ag+ sont connus pour être bactériostatiques.
Nous avons utilisé la même méthode d’évaluation de la bactério -compatibilité que celle utilisée sur les structures 3D dans le paragraphe 5.2.2.1 : les tests de diffusion sur milieu gélosé (analogues à l’antibiogramme de Kirby-Bauer). Pour les électrodes d’Ag/AgCl, un disque d’inhi- bition très distinct est visible pour la plupart des 9 micro-organismes testés (Figure 5-6). Cette électrode ne peut donc pas être utilisée pour notre mesure.
Figure 5-6 : Test de type Kirby-Bauer après 72h d’incubation sur une électrode d’Ag/AgCl déposée sur une lamelle de verre.
Par la suite, d’autres voies ont été explorées et une a réussi les tests type « antibio- gramme ». C’est cette électrode qui a été conservée pour les mesures in situ.
5.4. Analyse in situ de surnageant
La puce fonctionnelle présentée Figure 5-5 a été utilisée pour réaliser des premiers tests d’analyse de surnageants in situ au cours de la culture. L’expérience a été réalisée tout d’abord sur PP, puis sur plusieurs souches de PA dont PAO1 et PAO1DpqsA. Le protocole détaillé de ces
expériences est donné dans le paragraphe 5.6.4.
5.4.1. Expérience « test » sur Pseudomonas putida
Cette expérience a été réalisée dans un double but : tester le protocole avant de l’appli- quer en laboratoire L2 et fournir une courbe de référence d’analyse de surnageant pour une bac- térie n’étant pas rapportée comme électro-active.