Tests biologiques

Les cellules MCF-7 sont cultivées dans du RPMI complété (RPMI + 10 % SVF + 1 % PS) dans des flasques adhérentes. Pour récupérer les cellules, le milieu est aspiré, la flasque est lavée avec du PBS, de la trypsine est ajoutée, la flasque est mise 5 min à l’incubateur. Du milieu de culture est utilisé pour transférer dans un tube Falcon. Centrifugation à 1250 tours/min pendant 7 min. Le surnageant est aspiré et le culot est repris dans du milieu de culture.

Test MTT sur la lignée de cellules MCF-7

Des plaques de 96 puits sont préparées avec 5000 cellules/puits contenues dans 50 µL de milieu de culture et mises à incuber à 37 °C pendant 24 h. 50 µL de composés dilués dans PBS + Ca + Mg sont ajoutés, et mis à incuber à 37 °C pendant une nuit. Le milieu est aspiré, 100 µL de MTT à 0,5 mg/mL (dilution d’une solution à 5 mg/mL dans PBS+Ca+Mg dans le milieu de culture) sont ajouté et mis à incuber à 37 °C pendant 4 h. Le milieu est aspiré, 50 µL de DMSO sont ajoutés et incubation pendant 10 min à 37 °C. Lecture de l’absorbance à 560 nm. Les solutions mères des composés à tester son préparées dans le DMSO et sont diluées dans le PBS + Ca + Mg de manière à avoir 1 % en DMSO dans la solution finale.

Protocole internalisation cellulaire micelles : ces expériences sont réalisées par Nam NGUYEN QUANG (équipe du Dr. Frédéric Ducongé)

Micelles biotinylées :

Matériel :

- 6 plaques de 12 puits, culture cellulaire de MCF-7 pendant 3 jours, Vf = 500 µL de RPMI complété SVFi 10 % et Antibiotiques 1 % ; les cellules étaient à 80 % de confluence

- 900 µg de chaque micelles dans un Vf de 9 mL de DPBS Mg2+/Ca2+

- Trypsine-EDTA 1 ×

Protocole :

Le milieu des puits est aspiré. Lavage de 1mL avec du DPBS -/-. 500 µL de solution de micelles sont ajoutés dans chaque puits (100 µg/mL). Chaque plaque correspond à un temps d'incubation (30, 60, 90, 120, 180, 240 min) à 37 °C. Le milieu d'incubation est ensuite aspiré. 2 lavages de 1 mL sont réalisés avec du DPBS -/-. 100 µL de trypsine sont ajoutés dans chaque puits. Incubation 3 min à 37 °C. 300 µL de DPBS -/- complémenté avec du SVFi 10 % sont ajoutés pour inactiver la trypsine. Aspiration-refoulement pour décoller les cellules. Elles sont collectées dans des tubes eppendorfs, posés dans un bac à glace puis passées au cytomètre

Internalisation cellulaire après 90 min d’incubation et expérience de compétition avec de la biotine

Matériel :

- 3 plaques de 12 puits, culture cellulaire de MCF-7 pendant 3 jours, Vf = 500 µL de RPMI complété SVFi 10 % et Antibiotiques 1 % ; les cellules étaient à 100 % de confluence

194 - solution DPBS Mg2+/Ca2+ et biotine 2 mM pH 7,36

- 150 µg de chaque micelles dans un Vf de 1,5 mL du DPBS Mg2+/Ca2+

- 150 µg de chaque micelles dans un Vf de 1,5 mL de solution de biotine à 2 mM

Protocole :

Pour la plaque « pré incubation avec de la biotine »

- le milieu des puits de la plaque "pré incubation" est aspiré. Lavage de 1 mL avec du DPBS -/- - 500 µL de solution de biotine sont ajoutés à chaque puits de la plaque "préincubation" - incubation de la biotine 1 h à 37 °C

- le milieu des puits est aspiré

- 500 µL de solution de micelles avec biotine sont ajoutés dans chaque puits (100 µg/mL) - Incubation 90 min à 37 °C

- Le milieu d'incubation est ensuite aspiré. 2 lavages de 1 mL sont réalisés avec du DPBS -/- - 100 µL de trypsine sont ajoutés dans chaque puits. Incubation 3 min à 37 °C

- 100 µL de DPBS -/- complémenté avec du SVFi 10 % sont ajoutés pour inactiver la trypsine - aspiration-refoulement pour décoller les cellules. Elles sont collectées dans des tubes

eppendorfs, posés dans un bac à glace. - passage au cytomètre

Pour la plaque sans pré incubation

- le milieu des puits est aspiré. Lavage de 1 mL avec du DPBS -/-

- 500 µL de solution de micelles sans biotine est ajouté dans chaque puits (100 µg/mL) - Incubation 90 min à 37 °C

- Le milieu d'incubation est ensuite aspiré. 2 lavages de 1 mL sont réalisés avec du DPBS -/- - 100 µL de trypsine sont ajoutés dans chaque puits. Incubation 3 min à 37 °C

- 100 µL de DPBS -/- complémenté avec du SVFi 10 % sont ajoutés pour inactiver la trypsine - aspiration-refoulement pour décoller les cellules. Elles sont collectées dans des tubes

eppendorfs, posés dans un bac à glace. - passage au cytomètre

Pour la plaque témoin

- le milieu des puits est aspiré. Lavage de 1 mL avec du DPBS -/- - 3 puits incubés avec 500 µL de DPBS Mg2+/Ca2+ pendant 90 min

- 3 puits incubés avec 500µL de solution biotine 2 mM pendant 60 + 90 min

- Le milieu d'incubation est ensuite aspiré. 2 lavages de 1 mL sont réalisés avec du DPBS -/- - 100 µL de trypsine sont ajoutés dans chaque puits. Incubation 3 min à 37 °C

- 100 µL de DPBS -/- complémenté avec du SVFi 10 % sont ajoutés pour inactiver la trypsine - aspiration-refoulement pour décoller les cellules. Elles sont collectées dans des tubes

eppendorfs, posés dans un bac à glace. - passage au cytomètre

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Micelles fonctionnalisées avec un aptamère :

Internalisation cellulaire après 30 min d’incubation des micelles fonctionnalisées avec l’aptamère ACE4G

Tableau 12 : Internalisation cellulaire des micelles fonctionnalisées avec l’aptamère ACE4G :

Échantillon ACE4G ACEAscrG ^Micelles

oligonucléotide Micelles PDA-PEG2000 -alcyne/OMe 50:50 [aptamère]voulue ou [micelles]voulue

pour les contrôles

10 nM 10 nM 25 µg/mL 25 µg/mL Vmicelles (µL) [micelles oligonucléotide] = 1 mg/mL et [PDA-PEG2000 -alcyne/OMe 50/50] = 5 mg/mL / / 12,5 2,5 Vmélange aptamère-micelles [aptamère]totale = 0,236 µM 21,2 21,2 / / VDPBS Mg2+/Ca2+ (µL) ^{373,8 373,8 382,5 392,5} VtRNA (µL) 5 5 5 5 Vf (µL) 400 400 400 400

Cellules utilisées : MCF-7. Taille de la flask : 150 cm3

Enlever le surnageant de la flask. Laver avec 5 mL de DPBS--/--. Ajouter 1 mL de Versène. 5 min incubation à 37 °C puis aspiration refoulement pour détacher les cellules. transvaser dans Falcon 50 avec 5 mL de milieu complet (RPMI). Centrifugation swing out 1000 rpm (maximum 200-300 g) 5 min à 4 °C. Enlever le surnageant. Ajouter 500 µL de DPBS Mg2+/Ca2+. Prendre un échantillon de 50 µL de cellules, ajouter 50µL de DPBS et compter les cellules au FACS.

Ajouter les cellules dans les tubes de mixture préparés plus haut (Tableau 12). Incubation des cellules 30 min à 37 °C. Ajouter 5mL de DPBS Mg2+/Ca2+. Centrifugation swing out 1000 rpm (maximum 200-300 g) 5 min à 4 °C. Enlever le surnageant. Ajouter 5mL DPBS Mg2+/Ca2+. Centrifugation swing out 1000 rpm (maximum 200-300 g) 5 min à 4 °C. Compléter à 200µL avec du DPBS Mg2+/Ca2+. Aspirer/refouler. Analyse FACS (cytometre accuri C6). Garder les échantillons dans la glace pendant l'analyse.

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Chapitre 5 : Les micelles comme outils de diagnostic par IRM

I. Synthèse

N-(2-aminoethyl)pentacosa-10,12-diynamide (V-1)

Du 1-(10,12-Pentacosadiynoyloxy)-2,5-pyrrolidinedione (500 mg, 1.06 mmol, 1 équiv.) est dissous dans du DCM anhydre (6 mL). De l’éthylènediamine (0,7 mL, 10.6 mmol, 10 équiv.) est ajoutée rapidement et le milieu réactionnel est agité à t.a. sous N2, à l’abri de la lumière pendant 6 h. Le milieu réactionnel est lavé à l’eau et à la saumure. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée à sec. Un solide blanc (417 mg, 1.06 mmol) est obtenu.

Rendement : 100 %

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) (ppm)5.90 (br. s., 1H), 3.30 (q, J = 5.73 Hz, 2H), 2.83 (t, J = 5.85 Hz, 2H), 2.24 (t, J = 6.95 Hz, 4H), 2.15–2.21 (m, 2H), 1.14–1.70 (m, 32H), 0.80–0.93 (m, 3H)

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tri-tert-butyl 2,2',2''-(10-(2-oxo-2-((2-(pentacosa-10,12-diynamido)ethyl)amino)ethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triyl)triacetate (V-2)

Du DOTA-tris-tBu-ester (100 mg, 0.17 mmol, 1 équiv.), V-1 (71 mg, 0.17 mmol, 1 équiv.), de l’EDC,HCl (3 mg, 0.19 mmol, 1.1 équiv.) et de l’HOBt (35 mg, 0.26 mmol, 1.5 équiv.) sont mis en solution dans du DCM (2 mL). De la TEA (23 µL, 0.17 mmol, 1 équiv.) est ajoutée. Le milieu réactionnel est agité à t.a. sous azote pendant 15 h. Le milieu réactionnel est évaporé à sec. Le résidu est repris dans du DCM, lavé à l’eau et à la saumure. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée à sec. Le résidu brut est solubilisé dans du DCM et purifié sur colonne de silice (DCM 100 % -> DCM/MeOH 9:1). Un solide blanc pâteux (100 mg, 0.10 mmol) est obtenu.

Rendement : 61 %

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) (ppm) 9.15 (br. s., 1H), 8.43 (br. s., 1H), 3.36–3.50 (br. s., 9H), 2.29–2.40 (m, 4H), 2.15–2.29 (m, 6H), 1.41–1.55 (m, 29H), 1.25–1.33 (s, 26H), 0.84–0.92 (m, 3H) tous les signaux ne sont pas visibles, présence de signaux larges à cause des amines

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DA-DOTA (V-3)

Le produit V-2 (96 mg, 0.10 mmol) est solubilisé dans du DCM (4 mL) et du TFA (2 mL) est ajouté. Le milieu réactionnel est agité à t.a. sous azote pendant 10 h. Le milieu réactionnel est évaporé à sec, le résidu est repris dans de l’acétone, et évaporé. Cela est répété trois fois puis le résidu est repris dans le DCM et évaporé à sec. Une d’huile/cire (93 mg, 0.10 mmol) est obtenue. Le produit est obtenu sous forme de sels de TFA.

Rendement : quantitatif

1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (ppm) 8.61 (br. s., 1H), 7.90 (t, J = 5.21 Hz, 1H), 4.10 (br. s., 2H), 3.87 (br. s., 2H), 3.48–3.08 (br. s, 23H ), 2.76 (d, J = 4.21 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 6.86 Hz, 4H), 2.06 (t, J = 7.50 Hz, 2H), 1.37–1.56 (m, 6H), 1.21–1.37 (m, 28H), 0.77–0.90 (m, 3H) en adéquation avec le produit attendu

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DA-DOTA-Gd (V-4)

À V-3 (0.21 mmol, 1 équiv.) dans de l’eau déminéralisée (2 mL) (le pH est ajusté à 5.5 avec des solutions aqueuses de KOH 0.1 M et HCl dilué) est ajouté du Gadolinium (III) chloride hydrate (35 mg, 0.10 mmol, 0.5 équiv.), le pH est ajusté à 5.5 avec KOH 0.1 M. Le milieu réactionnel est chauffé à 60 °C pendant 17 h. L’eau est évaporée. La moitié du résidu brut est purifiée par LCMS préparative sur une Colonne Waters XSelect Fluorophényl 150 × 19 mm en 5 microns (élution : H2O/ACN 95:5 -> ACN 100 %). Un solide blanc (25 mg, 0.05 mmol) est obtenu.

Rendement : 25 %