Expériences en IRM- 19 F

Les imageries par résonnance magnétique du fluor ont été réalisées à Neurospin sur différents échantillons : i) du Perfecta encapsulé dans les micelles, ii) des micelles vides dans l’eau, iii) du Perfecta dans le chloroforme + quelques gouttes d’hexafluoroisopropanol pour la solubilisation, et iv) de l’hexafluoroisopropanol dans du chloroforme. Les expériences ont été réalisées sur un imageur avec une antenne 19F et opérant à 7 Tesla.

Les différentes solutions de composés fluorés ont été préparées avec des concentrations connues, et afin d’avoir un élément de comparaison, nous avons calculé pour chacun des lots les concentrations en élément fluor. Une première série d’expériences montre que l’hexafluoroisopropanol et le Perfecta peuvent être très facilement détectés par la technique d’imagerie. Ce résultat met en évidence la capacité de l’imageur et de la séquence développée par les RMNistes à détecter le fluor à des concentrations relativement fortes ([19F]>5 M). Lorsque la micelle est imagée seule, nous ne détectons pas de signal. Ici la concentration en fluor est de 0,1 M avec plusieurs résonnances possibles (donc moins de signal à une fréquence donnée) pour les différents atomes de fluor répartis dans la chaîne fluoro-carbonée. Enfin, lorsque les micelles-Perfecta ont été imagées, nous avons eu l’agréable surprise de pouvoir visualiser le Perfecta encapsulé au cœur des micelles. En effet, même si l’intensité du signal est encore modeste, nous observons après 40 s d’acquisition (Figure 70) une image distincte, la concentration en fluor étant 5 fois supérieure à celle des micelles vides.

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Figure 70 : Séquence IRM à 7 T acquise avec une antenne surfacique 19F (Tx/Rx) avec 2 averages en séquence RARE des

échantillons de micelles chargées avec du Perfecta ou non dans l’eau, du Perfecta avec l’hexafluoroisopropanol dans le chloroforme et de l’hexafluoroisopropanol dans le chloroforme

Le temps de relaxation T2 de la micelle-Perfecta a également été mesuré en utilisant une séquence

MSME et 24 TE (temps d’échos) et TR = 5000 ms. T2 s’obtient d’après la courbe du signal de résonance magnétique en fonction du temps d’échos (Figure 71). Nous obtenons une valeur de T2 de 184 ms pour les micelles chargées avec du Perfecta. Cette valeur est comparable avec celle obtenue dans la littérature pour la nanoémulsion de Perfecta (74,4 mM en Perfecta) qui est de 182 ms.145

Figure 71 : Détermination de T2

Les micelles chargées avec du Perfecta répondent aux critères énoncés précédemment puisqu’elles possèdent un grand nombre d’atomes de fluor magnétiquement équivalents, permettant un signal unique et distinct. La valeur de T2 mesuré est proche de celle mesurée pour une nanoémulsion du Perfecta décrite dans la littérature, ce qui nous conforte sur le potentiel IRM de notre système micellaire. Les micelles chargées avec l’agent de contraste vont maintenant être étudiées in vivo afin de confirmer leur potentiel en tant qu’outil nanométrique pour l’imagerie biomédicale.

III. Conclusion

Nous avons préparé deux types de contrastophores micellaires pour l’imagerie par résonance magnétique. Des micelles polymérisées contenant du gadolinium ont été assemblées et évalués en imagerie du proton. Les résultats obtenus montrent que la formulation micellaire offre un gain notable en ce qui concerne la concentration locale en élément rapporteur (Gd) et l’exaltation de la relaxivité des protons de l’eau environnante par empêchement de la libre rotation du complexe DOTA-Gd. Nous observons en effet une relaxivité améliorée d’un facteur 1,7 par rapport à celle du DOTA-Gd. Des études in vivo doivent encore être réalisées afin de valider le potentiel des micelles en imagerie biomédicale. Hexafluoroisopropanol dans CHCl3 [19F] = 5,2 M Perfecta + Hexafluoroisopropanol dans CHCl3 [19F] = 5,4 M

Micelles (10 mg/mL) avec Perfecta [19F] = 0,47 M

Micelles (10 mg/mL) [19F] = 0,1 M

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D’autre part, des micelles fluorées ont été préparées pour l’imagerie du fluor non radioactif. Ces micelles ont été chargées avec un élément rapporteur (le Perfecta) qui présente la particularité de ne porter que des atomes de fluor qui résonnent tous à une seule et même fréquence. Cette spécificité autorise la détection d’un signal unique et intense qui a pu être visualisé sur un imageur à 7 T. Nous envisageons également ici d’exploiter ces micelles pour de l’imagerie IRM in vivo. Ces études sont en cours.

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Nous avons au cours de cette thèse développé des formulations micellaires capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses dans le but de concevoir des outils pour la thérapie et le diagnostic.

Dans une première partie, nous avons montré que des micelles constituées d’une chimie de surface zwitterionique présentaient une biocompatibilité et une furtivité in vivo comparable aux micelles PEGylées classiquement utilisées jusqu’à présent. Ces formulations nanométriques incorporent une chimie de surface globalement neutre qui les rend compactes, furtives et leur confère une biocompatibilité accrue in vivo. Une biodistribution des micelles chargées avec un fluorophore émettant dans le proche infra-rouge a été réalisée chez le petit animal. Les résultats obtenus montrent que ces micelles s’accumulent de façon passive au niveau de la périphérie des tumeurs. Cette accumulation sélective permet de délimiter visuellement le volume de la masse tumorale et pourrait trouver son utilité dans la chirurgie assistée par imagerie de fluorescence en sécurisant l’exérèse tout en préservant les structures tissulaires saines.

Dans une deuxième partie, nous avons conçu des systèmes micellaires « intelligents » capables de libérer une cargaison médicamenteuse sous l’influence d’un stimulus. Nous avons ainsi préparé des micelles photosensibles qui, par activation UV, libèrent une entité cytotoxique. Nous avons essayé de transposer ce système pour pouvoir l’utiliser in vivo en y associant des nanoparticules à conversion ascendante (UCNP) qui sont excitables dans le proche infra-rouge. Des expériences préliminaires d’irradiation des UCNP encapsulées montrent que nous sommes limités par la puissance du laser utilisé. Une alternative pour dissocier la micelle serait de réaliser une excitation à deux photons. Les études sont en cours. Nous avons d’autre part également souhaité développer des micelles qui soient capables de se dissocier aux pH acides classiquement rencontrés dans les tissus tumoraux. Nous ne sommes toutefois pas parvenus à finaliser notre synthèse d’amphiphile acido-sensible.

Dans une troisième partie, nous avons préparé des systèmes micellaires fonctionnalisés avec de la biotine ou de l’aptamère ACE4G. Ces micelles ont été conçues de telle sorte à pouvoir cibler de manière active les cellules cancéreuses. Nous avons montré que l’internalisation cellulaire des micelles fonctionnalisées avec ces ligands était meilleure qu’en l’absence de ligands sur une lignée cancéreuse MCF-7. Nous avons également mis en évidence que l’internalisation des micelles était médiée par l’interaction entre le ligand et son récepteur. Il existe un taux de fonctionnalisation optimal qui est de 25 % (pour la biotine) puisque c’est ce recouvrement de surface qui nous donne les meilleurs résultats en termes de cinétique d’internalisation.

Dans le dernier chapitre, nous avons étudié des systèmes micellaires pour l’imagerie par résonance magnétique du proton et du fluor. Deux types d’agents de contraste ont été développés dont des micelles incorporant du gadolinium pour l’IRM du proton. Le métal a été associé aux micelles par l’intermédiaire d’une tête polaire DOTA. Des résultats préliminaires montrent que la formulation micellaire-Gd contient une concentration importante en gadolinium ce qui est favorable au contraste en imagerie. La relaxivité induite par la micelle-Gd est également 1,7 fois supérieure à celle du DOTA-Gd. Un deuxième type de micelle a été développé pour l’IRM du fluor. La formulation est constituée de micelles PEGylées perfluorées qui ont été chargées avec un élément rapporteur moléculaire (le Perfecta) qui présente 36 atomes de fluor magnétiquement équivalents. Les premiers résultats obtenus sur un imageur à 7 Teslas nous indiquent que le Perfecta peut être détecté dans la micelle à des concentrations telles que des expériences in vivo ont été programmées.

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Les réactifs chimiques ont été achetés et utilisés sans purification supplémentaire. Le dichlorométhane a été distillé sur CaH2 avant utilisation et le THF a été distillé en présence de sodium et de benzophénone avant utilisation.

Les chromatographies sur colonne ont été réalisées sur gel de silice (230-240 mesh, Merck). Les chromatographies sur couche mince ont été faites sur des plaques de type Silice Merck 60 F254 sur support de verre. Elles ont été révélées sous UV et/ou après immersion dans une solution éthanolique à 5 % d’acide phosphomolybdique ou une solution aqueuse de permanganate de potassium.

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Avance 400 dont les fréquences de résonance du proton, du carbone et du fluor sont 400.13 MHz, 100.62 MHz et 376.50 MHz, respectivement. Les déplacements chimiques δ sont exprimés en ppm. Les RMN du proton sont référencées de cette manière : déplacement chimique (δ ppm), multiplicité (s = singulet, d = doublet, t = triplet, q = quadruplet, quin = quintuplet, m = multiplet, br.s. = signal large), constante de couplage (Hz) et intégration.

Les spectres de masse ont été enregistrés avec un spectromètre Waters Micromass ZQ 2000 ESI. Les spectres infra-rouges ont été mesurés sur un appareil Perkin-Elmer 2000 FT-IR. Les longueurs d’ondes sont reportées en cm-1 à leur intensité maximale.

Les spectres UV ont été enregistrés sur un spectromètre Varian Carry 50 Scan.

Les mesures DLS ont été réalisées avec un Zetasizer Nano Serie de la société Malvern.

Les réactions photochimiques ont été réalisées avec une lampe UV Heraus à basse pression de mercure (254 nm), une lampe UV Heraus à moyenne pression de mercure couvrant une large gamme de longueur d’onde munie d’un tube à immersion en quartz et d’un tube de réfrigération en quartz ou une lampe Fisher Bioblock Scientific monochromatique (365 nm).

Les expériences d’irradiation à 980 nm ont été réalisées avec un laser titane saphir (Ti:Saph) de Spectra-physics modèle Tsunami en régime picoseconde avec une densité de puissance de 6 W/cm2.

La préparation des micelles par sonication est réalisée à l’aide d’une sonde à ultrasons Branson Sonifier 450 (60 W, 20 kHz).

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