Tests d’adhésion entre l’ADN et une surface d’or par des expériences de

expériences de fluorescence

On se propose de tester la différence d’affinité entre de l’ADN porteur ou non de groupes disulfide, avec l’or via une expérience de fluorescence.

Pour cela, on dispose de lamelles de verre sur lesquelles on dépose par évaporation une fine couche d’or. On injecte ensuite par capillarité, entre une de ces surfaces d’or nettoyées et une lamelle de verre, une solution d’ADN marqué par un fluorochrome, YOYO-1. Lors de

76 6. CONDUCTIVITÉ DE L’ADN

cette injection, les molécules d’ADN sont soumises à un flux représenté sur la figure 6.6A. Le fluorochrome nous permet de visualiser les molécules d’ADN à la proximité des surfaces d’or. On utilise pour cela le montage optique de l’équipe de Aurélien Crut et Pierre Desbiolles (Laboratoire Kastler Brossel, UMR 8552) : schématiquement, celui-ci illumine l’échantillon dans le visible (λ = 470 ±17 nm) et récupère la fluorescence émise (λ = 515 nm) sur une caméra CCD refroidie (voir la figure 6.6B). ADN Or eau lamelle de verre objectif 100X à eau excitation émission de fluorescence ADN Or eau lamelle de verre 1 2 3 4 A B ADN Or eau lamelle de verre 5 4 C 6 7

Figure 6.6:_{A. 1 Lorsque des molécules d’ADN sans AAdUTP sont injectées dans un "capillaire"(i.e.} une lamelle de verre et une couche d’or espacées par un peu de parafilm), 2 elles s’ancrent par une de leur extrémité à la surface d’or, 3 sont étirées par le flux du liquide qui continue d’avancer dans le capillaire 4 avant que la deuxième extrémité de la molécule s’ancre à son tour. On observe une assez grande proportion de molécules étirées, quasi parallèles entre elles. Les molécules qui ont rencontré la surface une fois que le capillaire était plein sont quant à elles collées en pelote sur la surface d’or B. On visualise ces molécules par un montage de fluorescence (excitation : λ = 490nm ; émission : λ = 515 nm) C. 5 à 7 l’émission de fluorescence décroît dans le temps et finit par casser en deux la molécule

Nous avons commencé par réaliser l’expérience avec une solution de tampon PB contenant de l’ADN de 10 kbp sans AAdUTP traité au DTSSP puis filtré, avec ou sans amorces biotine et digoxygenine. Dans ces deux cas, les résultats sont identiques. Premièrement, l’ADN non modifié, c’est à dire sans biotine, digoxygenine ou disulfide, possède toujours quelques paires de bases ouvertes à ses extrémités ("sticky ends" [3] p.987), qui ont plus tendance à se greffer sur des surfaces que le reste du double brin. Dans notre cas, une molécule d’ADN qui se colle par l’une de ses extrémités à la surface d’or lors de son injection, s’étire à cause du flux auquel elle continue d’être soumise. Elle finit donc immobile, étirée le long de la surface lorsque sa deuxième extrémité s’ancre elle aussi à la surface. On observe une assez grande proportion de molécules étirées, quasi parallèles entre elles, et d’autres molécules collées en pelote. Deuxièmement, l’émission de fluorescence n’est pas constante, le fluorochrome "s’usant" au cours du temps (phénomène de blanchiment). Enfin, on remarque que le fluorochrome inséré au coeur de la double hélice peut briser la molécule d’ADN après l’émission de photons (voir figure 6.6C) [120]. La molécule alors coupée en deux étant initialement ancrée à ses deux extrémités, les deux brins se regroupent en deux pelotes et on visualise expérimentalement deux points lumineux. La partie de gauche de la figure 6.7 représente trois photos prises à deux secondes d’intervalle, dans le cas de molécules porteuses d’amorces biotine et digoxygenine. Des cercles verts entourent les molécules étirées et immobiles sur la surface d’or.

Les résultats sont tout autre quand on utilise une solution de tampon PB contenant de l’ADN de 10 kbp avec AAdUTP traité au DTSSP puis filtré (donc porteur de groupes disulfide), sans

6. CONDUCTIVITÉ DE L’ADN 77

amorces biotine et digoxygenine t=0s

t=2s

t=4s

et groupes disulfide

amorces biotine et digoxygenine

Figure 6.7:_{à gauche : évolution dans le temps de l’émission de fluorescence de molécules d’ADN de 10} kb synthétisées par PCR avec des amorces fonctionnalisées à la biotine et à la digoxygenine à droite : évolution dans le temps de l’émission de fluorescence de molécules d’ADN de 10 kb synthétisées par PCR avec des amorces fonctionnalisées à la biotine et à la digoxygenine et porteuses de groupes disulfide. Les molécules étirées sont plus rares. La molécule entourée en rouge possède trois points d’ancrage distincts.

amorces biotine et digoxygenine. Dans cette expérience, réalisée plusieurs fois, la totalité des molécules d’ADN collées à la surface est alors en pelote. Cela peut s’expliquer si on imagine que les molécules possèdent plusieurs points d’ancrages le long de leur chaîne, et ne sont donc pas

78 6. CONDUCTIVITÉ DE L’ADN

étirées d’une extrémité à l’autre. Comme dans le cas précédent, l’émission de fluorescence décroît dans le temps.

La situation est quasi identique quand l’ADN porte des groupes disulfide et des amorces biotine et digoxygenine, mais nous avons tout de même réussi à voir quelques rares molécules étirées sur la surface lors d’une expérience. Celles-ci sont entourées sur les photos de la partie droite de la figure 6.7. L’une d’elles (entourée en rouge) possède trois points d’ancrage au lieu de deux, comme le prouvent les deux clivages successifs le long de sa double hélice (à t = 2 s et t = 4 s).

L’ADN portant des groupes disulfide colle donc à l’or, et semble posséder plus de points d’ancrage que l’ADN non modifié.

6.4

Synthèse des billes fonctionnalisées et assemblage