Les tests d’étude de la cytotoxicité

Les tests de cytotoxicité sont utilisés pour prédire la toxicité aiguë de substances chimiques pour les cellules et les tissus.

2.4.2.3.1 Test WST-1

WST-1 est un test colorimétrique d‘évaluation de la prolifération et de la viabilité cellulaire. Le test est basé sur la réduction d‘une molécule le WST-1 par la succinate déshydrohenase mitochondriale en un produit coloré le formazan (Fig. II.4.2). Plus la coloration est importante dans le milieu de culture, plus il y a eu de formazan formé et donc plus il y a de cellules conservant une activité mitochondriale. Ainsi, le test WST-1 indique

les effets chimiques sur le métabolisme mitochondrial et la toxicité respiratoire.

L‘absorbance est ensuite mesurée par spectrométrie à 450nm et comparée à l‘absorbance témoin afin de déterminer l‘effet cytotoxique des substances testées.

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2.4.2.3.2 Test de perméabilité cellulaire

Dans certaines conditions de culture, ces cellules ont la capacité de se différencier spontanément en cellules intestinales polarisées pour former un épithélium mimant une barrière intestinale fonctionnelle (présence de microvillosités, jonctions serrées, transporteurs spécifiques, enzymes du processus de métabolisation,…).

L'essai sur cellules Caco-2 permet d'évaluer la perméabilité intestinale d'un composé chimique, c'est à dire sa capacité à traverser la paroi intestinale pour rejoindre la circulation sanguine et se distribuer dans l'organisme. Les cellules Caco-2 sont cultivées sur une membrane microporeuse d'insert placé dans des chambres de culture individuelles. Après une période de culture de 21 jours, les cellules forment une monocouche différenciée isolant les compartiments supérieurs et inférieurs de la chambre de culture.

L'utilisation d'un tel système permet d'avoir un accès direct et aisé aux cotés apical (lumière intestinale) et basal (milieu intérieur) de l'épithélium intestinale, permettant ainsi l'évaluation des échanges de matières entre les 2 compartiments.

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Résultats et Discussion

► La première partie de cette section Résultats et Discussion concernera l‘impact de

la pollution en ETM sur un organisme clé du sol, le ver de terre (chapitre 3). L‘écotoxicité des ETM sur cet organisme sera investiguée et discutée en fonction de leur biodisponibilité. Les vers de terre, par leur activité de bioturbation vont modifier la mobilité, le transfert et la biodisponibilité des ETM dans les sols. C‘est pourquoi la deuxième partie de cette discussion (chapitre 4) portera sur l‘influence de la bioturbation des vers de terre sur le transfert des ETM dans le sol. Les ETM sont ensuite absorbés par les plantes par transfert racinaire et les végétaux ainsi contaminés sont consommés par les populations. Ainsi la troisième et dernière partie de cette section (chapitre 5) s‘intéressera à la bioaccessibilité gastro intestinale des ETM dans différentes matrices ainsi qu‘à leur toxicité sur la barrière intestinale.

► J‘ai choisi, pour le manuscrit, ce découpage qui met plus particulièrement en

évidence les interactions entre biodisponibilité, écotoxicologie et toxicologie. La biodisponibilité étant au centre de ma problématique de thèse.

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Chapitre 3

Evaluation de l’écotoxicité des métaux

sur les vers de terre

Avant-propos

Les effets délétères des ETM sur la santé des vers de terre ont été largement étudiés au cours de ces dernières décennies. Nombre d‘auteurs ont étudié l‘effet du plomb, zinc, cadmium et cuivre sur les vers de terre mais le plus souvent individuellement (cf. références citées ensuite dans la publication) et peu d‘études ont porté sur l‘impact des sols pollués par un cocktail de contaminants dans le cas de sources particulaires. De plus, ces études sont généralement focalisées sur du sol dopé par des solutions ou des particules riches en métaux. Il était donc important d‘étudier l‘effet d‘une pollution multi élémentaire sur un organisme terrestre tel que le ver de terre. Ainsi dans l‘étude qui suit, deux espèces de vers de terre ont été mises en contact, dans des microcosmes, avec un sol historiquement pollué par les rejets atmosphériques d‘une usine de recyclage de batteries au plomb contaminé en Pb, Zn, Cu, Cd, As et Sb.

Lors d‘une évaluation de risques sanitaires concernant les sols pollués en ETM, les notions de biodisponibilité ne sont pas prises en compte, seulement le sont les concentrations totales. Or, comme il sera illustré au cours de cette étude, à même concentration, les ETM ont un effet différent sur les vers de terre selon le type de sol testé. Afin de le démontrer, un sol historiquement pollué en ETM a été mélangé avec deux sols non contaminés aux caractéristiques physico-chimiques différentes afin d‘en diluer les concentrations en ETM. La bioaccumulation des ETM par les vers de terre exposés à des sols aux caractéristiques contrastées s‘est révélée différente. De plus, cette bioaccumulation a été corrélée aux effets observés des ETM sur les vers de terre. Ces effets ont été évalués grâce à différents paramètres écotoxicologiques : la mortalité, l‘évolution de la biomasse et la cast production. Les études d‘impact sont généralement réalisées avec l‘établissement de DL50 (concentrations en contaminants provocant 50% de mortalité dans la population d‘organismes étudiés), parfois l‘évolution de la biomasse et les effets sur la reproduction (production de cocons). Il y

55 a un manque de paramètres d‘évaluation écotoxicologique pertinents adaptés aux rôles écologiques des vers de terre dans les sols. C‘est pourquoi dans cette étude, un test mis en place par Capowiez et al., (2010) puis modifié par Dittbrenner et al., (2011) a été utilisé : la cast production. C‘est la mesure de la production de turricules par les vers de terre. C‘est un paramètre écotoxicologique comportemental puisqu‘il permet d‘évaluer l‘activité de bioturbation des vers de terre dans les sols.

En résumé, cette étude porte sur l‘impact des ETM sur deux espèces de vers de terre de groupes écologiques différents. Le sol testé est un sol pollué historiquement par les rejets atmosphériques et diffus d‘une entreprise de recyclage de batteries au plomb et il est contaminé par un cocktail d‘ETM. Il est intégré l‘étude la biodisponibilité des ETM pour les vers de terre avec l‘identification de paramètres physico-chimiques du sol influençant cette dernière. Enfin, la cast production, test écotoxicologique pertinent pour évaluer le rôle écologique des vers dans le sol a été utilisé. Les objectifs de cette étude sont résumés dans le schéma ci-dessous (Figure III.1.1)

Figure III.1.1 : objectifs de l’étude d’impact des ETM sur les ver de terre

► Le travail réalisé dans ce chapitre a été valorisé par une publication acceptée dans la revue Environmental Pollution : Lévêque et al. 2013. « Assessing ecotoxicity and uptake of metals and metalloids in relation to two different earthworm species”. Environmental Pollution 179, 232-241.Cette publication est présentée dans son ensemble ci-dessous.

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