IMP MEM
Témoin 0.25 0.047
Col 1 6 2
Col 2 6 2
L’espèce Aeromonas veronii bv sobria, agent pathogène majeur de ce genre bactérien, est connu pour posséder, comme la plupart des espèces appartenant au genre Aeromonas, une metallo-β-lactamase chromosomique inductible capable d’hydrolyser les carbapénèmes (Stunt et al., 1998). Chez l’espèce Aeromonas hydrophila, cette enzyme est codée par le gène cphA. Cette metallo-β-lactamase appartient à la classe moléculaire B et est dépendante du zinc pour son expression. En absence de zinc, ces bactéries testées in vitro selon les tests standard d’antibiose, montrent un profil de sensibilité aux antibiotiques de la famille des carbapénèmes (Stunt et al., 1998).
Le profil de résistance de la souche clinique parentale de l’espèce Aeromonas veronii bv sobria a été déterminé en absence de zinc et selon les normes standard CLSI. Il est alors
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possible que la sensibilité de cette souche à l’imipenem et au meropenem soit en réalité due, non pas à une absence génétique du mécanisme de résistance, mais plutôt à l’absence de l’expression de la carbapénèmase. Les colonies devenues résistantes suite à l’exposition à 7 µg/ml de ceftriaxone, 7 µg/ml de ciprofloxacine et 0.4 µg/ml d’érythromycine pourraient être des mutants de dérepression pour l’expression de la carbapénèmase.
L’EDTA est un chélateur chimique connu pour inhiber l’activité des carbapénèmases. Celui-ci est utilisé pour la détection de ces enzymes, au même titre que l’aCelui-cide clavulanique est employé pour la détection des ESBL.
Afin de tester la présence de la carbapénèmase, un antibiogramme contentant deux disques l’un imprégné d’imipenem et l’autre imprégné d’imipenem et d’une goutte de solution contenant 750 µg/25 µl d’EDTA a été effectué en parallèle sur la souche parentale et sur les colonies induites (photo 12).
Photo 12 : Antibiogramme de la souche parentale d’Aeromonas veronii bv sobria (Pétri 1) et des colonies induites (Pétri 2, 3, et 4).
Disque de gauche : imipenem ; Disque de droite : imipenem + EDTA.
Les résultats montrent que la souche clinique possède approximativement les mêmes diamètres de la zone d’inhibition à l’imipenem aussi bien en présence, qu’en absence d’EDTA (photo 12, Pétri 1). Ici, la souche n’exprimant pas la carbapénèmase n’est en rien affectée par la présence du chélateur chimique et reste sensible à l’imipenem. En revanche, en présence d’EDTA, les colonies induites, résistantes à l’impenem, redeviennent sensibles à cet antibiotique (photo 12, Pétri 2, 3 et 4).
Certains travaux, effectué notamment chez l’espèce Aeromonas veronii bv sobria, ont montré qu’un unique point de mutation peut résulter en une dérepression de la carbapénèmase, ainsi qu’en la dérepression coordonnée des deux autres β-lactamases produites par cette espèce, à savoir une pénicillinase du groupe 2d (classification de Bush) et une céphalosporinase du groupe 1 (Walsh et al., 1995). La fréquence pour une telle mutation (10-7-10-8) est connue pour être plus élevée lorsque les essais d’induction sont effectués à 30°C (Walsh et al., 1997).
Il est ainsi concevable qu’une surexpression de la carbapénèmase due à une unique mutation, par exemple dans un activateur transcriptionnel du gène, puisse être corrélée au phénotype de résistance obtenu pour cette souche.
Il est inquiétant de penser qu’une exposition unique de 24 heures à des concentrations hydriques de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine puisse conduire in vitro à de telles diminutions de sensibilité pour un antibiotique si largement utilisé et si efficace à ce jour. Une telle mutation dans une infrastructure clinique pourrait engendrer d’importants et graves échecs thérapeutiques.
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3..55..22..33 Acinetobacter, souche environnementale exposée à la Ceftriaxone,à la Ciprofloxacine et à l’Erythromycine
La souche environnementale d’Acinetobacter ne semble pas affectée par la présence in vitro des plus basses concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine détectables dans les eaux usées des hôpitaux.
En effet, après 24 heures d’exposition à 7 µg/l de ceftriaxone, 7 µg/l de ciprofloxacine et 0.4 µg/l d’érythromycine, le nombre de colonies dénombrables est de 5.2x107 UFC/ml, soit un chiffre comparable à celui obtenu pour la souche parentale témoin non exposée (5.5x107) (tableau 54, expérience 1). La mesure du trouble de la suspension bactérienne au spectrophotomètre soutient cette observation (graphique 36).
Graphique 36 : Croissance de la souche environnementale d’Acinetobacter en fonction des concentrations de ceftriaxone (CRO), de ciprofloxacine (CIP) et d’érythromycine (E) (mesure par spectrophotomètre).
Les concentrations hydriques plus élevées des trois inducteurs, à savoir 14 µg/l de ceftriaxone, 20 µg/l de ciprofloxacine et 1 µg/l d’érythromycine induisent une faible diminution de la croissance de la souche exposée. Cette réduction de la croissance est visible par la mesure spectrophotométrique du trouble de la suspension bactérienne, ainsi que par le dénombrement des colonies, ces dernières descendant à 8.6x106 UFC/ml, contre 5.5x107 pour la souche témoin (graphique 36 ; tableau 54).
Après 24 heures d’exposition à ces concentrations hydriques des trois inducteurs, les CMI pour la ceftriaxone, la ciprofloxacine et l’érythromycine, ainsi que les diamètres des zones d’inhibition de croissance mesurés pour l’ensemble des 12 antibiotiques testés sont identiques entre la souche témoin et la souche exposée (tableaux 54 et 55, expériences 1 et 2). La faible réduction de croissance induite in vitro par cette exposition, n’est, ainsi, pas associée à une modification du profil de résistance de la souche.
Turbidimétrie
0 0.050.1 0.150.2 0.250.3 0.35 0.4
0 7 14 21 100 500 1000 2000
0 7 20 45 100 200 500 1000
0 0.4 1 4 10 30 60 100
Absorption (600nm)
Souche environnementale
[CRO] µg/l [CIP] µg/l [ERY] µg/l
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L’exposition de 24 heures à des concentrations plus élevées des trois inducteurs affecte plus sévèrement la capacité de croissance de la souche. En effet, un mélange de 21 µg/l de ceftriaxone, de 45 µg/l de ciprofloxacine et de 4 µg/l d’érythromycine réduit le nombre d’UFC/ml à 2.6x104. A ces mêmes concentrations, l’absorption mesurée atteint la valeur 0, indiquant à nouveau une sensibilité moins grande de l’estimation de la croissance par la méthode spectrophotométrique.
Une faible proportion de la population de l’ordre de 102 UFC/ml maintient sa capacité de croître jusqu’à des concentrations de 500 µg/l de ceftriaxone, 200 µg/l de ciprofloxacine et 30 µg/l d’érythromycine (tableau 54).
Enfin, une inhibition totale de la croissance apparaît après 24 heures d’exposition à des concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine respectivement de 1000 µg/l, 500 µg/l et 60 µg/l (tableau 54).
Tableau 54 : UFC/ml et E-Tests de la souche environnementale d’Acinetobacter après exposition aux diverses concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine.
Exposition (24h.) E-Tests : CMI (µg/ml) Acinetobacter,
CRO : ceftriaxone ; CIP : ciprofloxacine ; E : érythromycine UFC : unité formant des colonies
Bleu : concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine détectables dans les eaux usées des hôpitaux
Vert : profil de sensibilité (en référence aux normes CLSI)
La faible sous population sélectionnée lors des expériences 3, 4 et 5 par la présence des concentrations élevées des trois antibiotiques (tableau 54) semble, au contraire de ce qui pourrait être attendu, légèrement plus sensible que la souche parentale. En effet, en comparaison à cette dernière, les valeurs des concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour la ceftriaxone et la ciprofloxacine diminuent légèrement. De la même façon, les diamètres des zones d’inhibition de croissance pour l’ensemble des bêta-lactames et pour le quinolone et les deux fluoroquinolones testés par antibiogramme sont légèrement plus larges que ceux mesurés pour la souche parentale (tableau 55). Cette apparente augmentation de la sensibilité des colonies, après exposition, peut être expliqué par le fitness réduit de la population bactérienne exposée. En effet, la population survécue aux expositions à des concentrations élevées des trois inducteurs, présente in vitro des colonies plus fines, plus petites et non uniformes. Cette réduction du fitness affecte ainsi la croissance de la souche in vitro. Les zones d’inhibition se formant autours des disques et bandelettes imprégnés d’antibiotiques lors des tests d’antibiose sont irrégulières et non bien définies. La lecture des résultats est, de ce fait, rendue plus imprécise.
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Tableau 55 : Profil phénotypique de résistance de la souche environnementale d’Acinetobacter après exposition aux diverses concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine.
Antibiogramme : Diamètres ZI (mm) Acinetobacter, ceftriaxone ; FEP : céfépime ; NA : acide nalidixique ; CIP : ciprofloxacine ; NOR : norfloxacine ; E : érythromycine ; CLR : clarithromycine
Vert : profil de sensibilité (en référence aux normes CLSI)
Des colonies présentant une modification du pattern de résistance ont pu être isolées uniquement suite à une deuxième exposition aux concentrations élevées de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine.
Ici, des colonies exposées 24 heures aux concentrations hydriques les plus faibles (7 µg/l, 7 µg/l et 0.4 µg/) et aux concentrations hydriques les plus élevées (14 µg/l, 20 µg/l et 1 µg/l) des trois inducteurs ont été secondairement exposées à des concentrations supérieures à celles pouvant être détectées dans les eaux usées des hôpitaux.
La deuxième exposition confronte ainsi les colonies isolées, soit à 100 µg/l de ceftriaxone, 100 µg/l de ciprofloxacine et 10 µg/l d’érythromycine, soit à 500 µg/l, 200 µg/l et 30 µg/l des trois mêmes inducteurs (tableau 56).
Ces expériences n’ont permis d’isoler qu’entre 10 et 165 colonies. Les deux expositions successives réduisent la croissance de la souche plus fortement encore qu’une simple exposition de 24 heures.
Tableau 56 : UFC/ml et E-Tests de la souche environnementale d’Acinetobacter après deux expositions de 24 heures aux diverses concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine.
CRO : ceftriaxone ; CIP : ciprofloxacine ; E : érythromycine UFC : unité formant des colonies
Bleu : concentrations de ceftriaxone, de ciprofloxacine et d’érythromycine détectables dans les eaux usées des hôpitaux
Vert : profil de sensibilité (en référence aux normes CLSI)