Technologie des puces à ADN « deux couleurs » pour l’étude du transcriptome

L’objectif de cette partie est de donner un bref aperçu de la technologie des puces à ADN deux couleurs, utilisée dans le cadre de cette thèse, pour analyser le transcriptome. Pour

plus de détails sur la diversité des microarrays, leurs fabrications et leurs utilisations, le lecteur pourra se référer à l’article de Bogard et al. (2008).

I.4.1.

Définition et principe

Une puce à ADN (ou biopuce, biochips, DNA-microarrays ou microarrays) est un support (membrane de nylon, lame de verre ou de silicium) sur lequel une collection de fragments d'ADN, de séquence nucléotidique connue, a été fixée de façon ordonnée. Les fragments d’ADN de séquence connue sont appelés des sondes. La technique des puces à ADN permet de quantifier le niveau d'expression des gènes, représenté par le nombre de transcrits, dans une cellule ou un tissu donné (foie, intestin, glande mammaire...), à un instant donné du développement ontogénétique (embryon, adulte...) ou dans un état physiopathologique donné (malade/sain, gestation, lactation ...).

Le principe de la puce à ADN repose sur la propriété qu’ont deux molécules d’acide nucléique monocaténaires de s’apparier de façon spécifique, lorsqu’elles présentent un degré de complémentarité suffisant. Concrètement, les ARN totaux sont extraits des cellules et convertis en ADN complémentaires (ADNc) par la technique de transcription inverse. Cette étape de rétro-transcription peut être simultanée ou suivie du marquage par deux fluorochromes tels que les Cyanine 3 (Cy3, verte) et 5 (Cy5, rouge). Les ADNc marqués sont communément appelés cibles (complexes). Une fois marquées ces cibles sont hybridées sur les sondes de la lame de verre. Cette hybridation doit être hautement spécifique entre la cible et la sonde dans les conditions expérimentales utilisées. En système hétérologue (où la sonde et la cible sont de deux espèces différentes), la spécificité peut être légèrement diminuée, l’hybridation peut se faire même s’il existe quelques mismatches.

La technologie des puces à ADN a pour origine une technique de biologie moléculaire appelée Northern Blot, adaptée aux ARN à partir de la technique du Southern Blot développée par Southern en 1975 (revue dans Saluz et al., 2002). Le Northern Blot consiste à séparer dans un gel, par électrophorèse, les ARN extraits d’un tissu dont on veut analyser le profil d’expression génique. Les ARN sont ensuite transférés par adsorption sur une membrane de nylon. Les ARN fixés sur la membrane sont révélés par hybridation d’une sonde nucléotidique spécifique d’un gène donné, marquée radioactivement. Si l’ARN de ce gène est présent sur la membrane, une bande est alors révélée. La technique des puces à ADN procède de façon semblable en multipliant le nombre de sondes géniques révélées en une seule hybridation.

I.4.2.

Les différents types de « puces à ADN »

Les différents types de réseaux existant se définissent par la nature du support, le type de sondes déposées, la densité du dépôt et le type de marquage des cibles.

Depuis sa création, la technologie des puces à ADN a connu deux évolutions majeures (Saluz et al., 2002). La première évolution a porté sur la nature du support utilisé. Il y a eu miniaturisation du support et passage à des lames de verre. La seconde évolution a concerné les sondes présentes sur le support. Vers 1994 est apparu, avec les puces Affymétrix, la synthèse in situ des séquences oligonucléotidiques, directement sur le support. Ce nouveau mode de fabrication est venu concurrencer le dépôt (spotting) et a permis d’augmenter la densité de gènes présents sur le support (Saluz et al., 2002).

Les sondes spottées sur les lames sont soit des produits de PCR ou des séquences oligonucléotidiques synthétisées chimiquement. Ces sondes sont de séquence connue et peuvent être identifiées comme une séquence exprimée, mais non annotée (« Expressed Sequence Tag », EST) ou correspondre à un gène parfaitement caractérisé.

Les macro-réseaux ou « macroarrays » sont le plus souvent des membranes de nylon sur lesquelles ont été déposées des produits de PCR issus de l’amplification de banques d’ADNc. Les cibles complexes hybridées sur ces réseaux sont marquées radioactivement. Il n’y a qu’un seul échantillon hybridé par membrane, mais une membrane peut être deshybridée et resservir dans plusieurs expériences. La densité des sondes déposées sur la membrane est d’environ 100 sondes/cm².

Les micro-réseaux ou « microarrays » sont essentiellement des lames de verre sur lesquelles ont été déposés des produits de PCR de banque d’ADNc ou des oligonucléotides. Sur ce type de réseaux, les oligonucléotides ont généralement une taille comprise entre 40 et 80 nucléotides. Les cibles complexes hybridées sur ces réseaux sont classiquement marquées par des fluorochromes et une à trois conditions expérimentales (généralement deux) peuvent être hybridées sur une même lame. La densité de dépôt des sondes sur la lame est de 2 000 sondes/cm².

Dans le cas de sondes synthétisés in situ, la densité des sondes sur le micro-réseau peut augmenter pour passer de 12 000 sondes/cm² (puces Agilent) à 162 000 sondes/cm² (puces Nimblegen).

Dans ce travail de thèse trois types de puces à oligonucléotides bovins ont été utilisés, suivant leur disponibilité (cf. Tableau I.5).

Tableau I-5 : Caractéristiques des trois puces à ADN utilisées dans ce travail de thèse

Lame Agilent

Taille de oligonucléotides 60mer

Méthode de fabrication de la lame Synthèse in situ

Lieu de fabrication Agilent USA

Nombre de réseaux par lame 4

Nombre de spots par réseau 44 407

Nombre de set par réseau 1

Nombre de séquences

oligonucléotidiques (sondes) différentes par réseau

21 475

Nombre de gènes différents par set ayant

une annotation acceptée par IPA 13 746

Nom des sets Clermont Illumina Agilent

Nombre de séquences

oligonucléotidiques (sondes) différentes par set

50 13 257 21 475

Nombre de gènes différents par set ayant

une annotation acceptée par IPA 46 8 058 13 746

Type de marquage Amplification et marquage direct

(Agilent Technologies)

Pré-hybridation Pas de pré-traitement

Hybridation Four à hybridation Agilent (Agilent

Technologies)

Lavage Gene Expression Wash Buffer Kit

(Agilent Technologies) * CRB-GADIE : Centre de Ressource Biologique Génomique des Animaux Domestiques et d' Intérêt Economique

Chambres Corning Four à hybridation Agilent (Agilent Technologies)

Universal microarray hybridation kit (Promega, France)

Succession de solutions de concentration décroissante en SSC et SDS

6 656 9 973

Direct Pronto (Promega, France) Indirect (Invitrogen, France) ou Amplification et marquage direct

Opéron 8 329 6 629 8 379 21 586 1 23 232 2 1 19 200 2

Universal microarray hybridation kit

(Promega, France) Solution de BSA

Lame Opéron 70mer Spotting Génopôle de Toulouse Lame du CRB 70mer Spotting CRB-GADIE* Jouy-en-Josas

 Les lames Operon sont des lames utilisées par Ollier & al. (2007). Ces lames contiennent le set d’oligonucléotides bovins commercialisé par la société Opéron (n=8 329) auquel ont été ajoutés 50 oligonucléotides (appelé set « Clermont » dans le Tableau I.5, numéro d’accession GEO : GPL4594). Les oligonucléotides sont des 70mer, c’est à dire qu’ils comportent 70 nucléotides. Ces oligonucléotides ont été déposés (spottés) en dupliqua sur des lames UltraGAPS (Corning B.V. Life Sciences) sur la Plateforme « Biopuces » de la génopôle de Toulouse Midi Pyrénées INSA/DGBA. Ces lames comportent 19 200 spots correspondant à 8 379 séquences oligonucléotidiques différentes dont 6 656 (soit 79,4 %) sont des gènes différents ayant une annotation reconnue par le logiciel Ingenuity Pathway Analysis (IPA).  Les lames du CRB (Centre de Ressources Biologiques GADIE1, Inra, Jouy-en-Josas)

ont été produites en associant le set d’oligonucléotides (70mer) bovins commercialisé par la société Operon (n=8 329) et le set d’oligonucléotides synthétisés par la société Illumina (n=13 257, numéro GEO : GPL2853). Ces oligonucléotides ont été spottés par le CRB-GADIE, sur des lames UltraGAPS (Corning B.V. Life Sciences). Les lames comportent 23 232 spots correspondant à 21 586 sondes (séquences) différentes dont 9 973 (soit 46,2 %) sont des gènes différents ayant une annotation acceptée par IPA. Le faible nombre de gènes par rapport au nombre de sondes s’explique en partie par le fait qu’il existe une certaine redondance entre les 2 sets commerciaux, et donc que certains gènes sont représentés par 2 (parfois davantage) sondes, mais aussi et surtout en raison de la pauvreté de l’annotation du génome bovin en séquences exprimées.

 Les lames Agilent sont fabriquées par la société Agilent (Agilent Technologies). La synthèse des oligonucléotides (60 mers) est réalisée in situ, c’est à dire directement sur la lame, par ajout successif de nucléotides, selon un principe dérivé du système mis au point par Hewlett Packard (HP) pour ses imprimantes à jet d’encre. Cette technologie permet de densifier le nombre de spots présents sur la lame de verre. Les lames Agilent comportent quatre réseaux de 44 407 spots correspondant chacun à 21 475 sondes différentes (synthétisées en dupliqua) dont 13 746 (64 %) sont identifiées comme correspondant à des gènes différents ayant une annotation reconnue par IPA.

I.4.3.

Les différentes étapes mises en œuvre pour la réalisation

d’une analyse transcriptomique différentielle sur puces à ADN

L’objectif de cette partie est de présenter succinctement les étapes successives d’une expérimentation de puce à ADN.

I.4.3.1.

La planification expérimentale

L’expérimentation sur puces à ADN comporte de nombreuses étapes qui sont autant de source de variabilités. Malgré l’importance de ces variabilités, certains biais peuvent être contrôlés et d’autres ne le peuvent pas (ils sont alors dits aléatoires). Les biais contrôlables peuvent être réduits en utilisant des procédures expérimentales strictes comme par exemple un même manipulateur pour une même expérience. Les biais aléatoires constituent un bruit qui réduit la puissance des analyses statistiques et la fiabilité des résultats.

La première étape de l’expérimentation sur puces à ADN pour un biologiste est donc de construire un plan expérimental approprié qui permettra de contrôler et corriger les biais liés à la technique et d’optimiser l’analyse statistique employée pour répondre à la question biologique posée (Mary-Huard et al., 2006). L’objectif d’un plan expérimental est d’organiser l’analyse biologique pour en retirer l’information la plus précise dans un nombre limité d’expériences. Le plan expérimental est une construction de l’expérience qui répond aux exigences scientifiques et statistiques en tenant compte des contraintes de quantité, de temps et de budget. La puissance d’un plan expérimental peut être optimisée en minimisant la variance des estimateurs de l’effet étudié.