Prélèvements et analyse des tissus mammaires

Biopsie de tissus mammaires et extraction des

ARN

Les biopsies de tissus mammaires ont été effectuées selon la méthode décrite par (Farr

et al., 1996) dans la partie supérieure de la mamelle droite non traite depuis la veille et

préalablement anesthésiée. Les biopsies ont été rincées dans de l’eau physiologique (9g de NaCL dans 1 L d’eau distillée) avant d’être congelées dans de l’azote liquide, puis conservées à -80°C jusqu’à leur analyse. Les biopsies congelées ont été broyées dans un Cryobroyeur 6750 (Fisher Scientific Bioblock), sous azote liquide. Les ARN totaux ont été extraits des poudres résultantes par le réactif TRIzol en suivant les instructions du fabricant (Invitrogen, France). La phase aqueuse récupérée a ensuite été traitée à la DNase sur des colonnes Cleanup (Qiagen). Les ARN totaux ainsi extraits ont été conservés à -80°C. La quantité d’ARN a été évaluée en spectrophotométrie par détermination du ratio 260/280 nm sur le Nanodrop ND- 1000 (Nanodrop Technology, Nixor Biotech, France). La qualité de chaque échantillon a été évaluée avec le Bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, France), en utilisant la puce Nano 6000. Les échantillons dont le RIN (« RNA Integrity Number ») était inférieur à 7,6 ont été éliminés de l’expérience.

Profilage d’expression génique sur microarrays

♦ Marquage des cibles complexes

La préparation des cibles complexes marquées à partir des ARN totaux extraits des biopsies mammaires a été réalisée avec le kit « Low RNA Input Linear Amplification »

(Agilent Technologies, France) en suivant les instructions fournies par le fabricant. Brièvement, les ARN totaux ont été rétro-transcrits en ADNc par l’enzyme MMLV-RT. Les ADNc ont été ensuite transcrits en ARNc. Cette étape permet une amplification linéaire du nombre de molécules d’ARNc synthétisés et l’incorporation directe des cyanines liées à des CTP dans les chaînes nucléotidiques. Les ARNc marqués ont ensuite été séparés des cyanines non incorporées sur colonnes RNeasy (Qiagen, France). La fréquence d’incorporation (FOI) des cyanines (pmol/µg) et la concentration d’ARNc (pmol/µl) ont été estimées en mesurant au Nanodrop les absorbances à 260 nm, 550 nm et 650 nm. Les ratios suivants ont été calculés : FOI (Cy3) = (Abs550 x 103) / (6 x Abs260) ; FOI (Cy5) = (Abs650 x 100) / Abs260. Lorsque les FOI étaient inférieures à 8, les échantillons étaient écartés.

L’hybridation des cibles complexes a été réalisée selon un plan expérimental comparant deux conditions, en considérant les couples de vaches décrits précédemment (cf. Figure III.2) comme des répétitions biologiques et en effectuant des dye-swap pour les répliquas techniques.

Pour cette expérience, les cibles complexes marquées ont été hybridées, selon le même plan expérimental, sur deux types de lames à oligonucléotides (oligoarrays) bovins : les lames 4 x 44K commercialisées par Agilent (Agilent Technologies, France) et les lames 22K spottées au CRB-GADIE de Jouy-en-Josas (INRA, France).

♦ Hybridation des cibles complexes sur les lames bovines

4 x 44k Agilent

Les cibles complexes ont été hybridées sur les lames bovines 4 x 44K commercialisées par Agilent en suivant le protocole « Two Color Microarray-Based Gene Expression Array » et en utilisant le kit Agilent « Gene Expression Hybridization ». Chaque cible marquée (825 ng) était déposée sur les réseaux après fragmentation ([1x] Fragmentation Buffer 30 min à 60°C). Les lames étaient hybridées 17h à 65°C et 10 rpm dans un four à hybridation (Agilent Technologies, France). A l’issue de l’hybridation et du lavage, les cyanines fixées sur les lames ont été protégées de l’ozone par immersion des lames 30s dans une solution de stabilisation et de séchage (Agilent Technologies, France). Les lames ont été scannées sur un scanner Agilent (Agilent Technologies, France), à une résolution de 5 µm et en effectuant les acquisitions à 10 et 100 % de la puissance des lasers (option XDR, « eXtended Dynamic Range »).

♦ Hybridation des cibles complexes sur les lames bovines 22K du CRB-GADIE

Avant hybridation, les lames 22K bovines du CRB-GADIE (INRA, France) ont été pré-hybridées dans une solution de sérum albumine bovine (BSA, 1 g pour 100 ml) 30 min à 50°C, puis rincées dans de l’eau ultra pure avant d’être séchées. Chaque cible complexe marquée (entre 2,7 et 6 µg) était déposée sur les lames après fragmentation ([1x] Fragmentation Buffer 30 min à 60°C), en veillant à ce que la même quantité d’ARNc soit déposée sur les deux lames d’un dye-swap. Les lames ont été hybridées 20h à 60°C et 10 rpm dans un four à hybridation (Agilent Technologies, France). Après l’étape d’hybridation, les lames ont été lavées à température ambiante deux fois 5 minutes sous agitation orbitale dans une solution (2X SSC, 0.1% SDS), avant d’être successivement lavées deux fois 5 minutes dans une solution (0,5X SSC, 0,1% SDS), puis 5 minutes dans une solution (0.1X SSC, 0.1% SDS), 3 x 5 minutes dans une solution (0,1X SSC) et 1 minute dans de l’eau ultra pure, puis séchées à l’air comprimé. Les lames étaient enfin scannées sur un scanner Agilent (Agilent Technologies) avec une résolution de 10 µm et en sélectionnant l’option XDR.

L’intensité du signal fluorescent pour chaque spot de chaque image a été quantifiée au moyen du logiciel « Feature Extraction » v9.1.3.1 (Agilent Technologies, France).

Quantification en PCRq

La validation des différentiels d’expression des gènes DGAT1, CSN3 (caséine κ) et

CSN1S1 (caséine αs1) a été effectuée par PCR quantitative en temps réel. Pour cela, 500 ng

d’ARN total ont été rétrotranscrits en ADN complémentaire en présence de 0,5 µg de primer Oligo(dT) 12-18 et de SuperScriptTM III (Invitrogen, France). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée, en présence de SyBr Green, dans les conditions décrites par (Bevilacqua et

al., 2006). Au total, 3 gènes ont été validés par PCRq avec la protéine ribosomale S24 et la

cyclophiline comme contrôles internes. Les paires d’amorces dont les séquences sont données au Tableau III.1 ont été déterminées à l’aide du logiciel « Primer Express » v2.0 (Applied Biosystems, France). Afin d’éviter l’amplification de l’ADN génomique, les amorces ont été préférentiellement positionnées sur des jonctions Exon-Exon. Les amorces ont été synthétisées par MWG Biotech (France). L’analyse des données de PCRq a été effectuée en normalisant chaque quantification par les deux gènes contrôles internes (protéine ribosomale

24S et cyclophiline) puis en calculant la moyenne des ratios pour chaque transcrit entre deux individus d’un même couple.

Tableau III-1 : Amorces des systèmes optimisés pour doser les transcrits en PCRq.

Chaque paire d’amorce amplifie un ADNc cible (la taille des amplicons variant entre 58 et 66 nucléotides). Les paires d’amorces ont été déterminées avec le logiciel « Primer Express » v2.0 (Applied Biosystems) à l’exception du système ciblant le transcrit spécifiant la protéine ribosomale 24S dont le « design » a été établi manuellement.

Gènes Amorces Séquence 5'_3' Taille de l'amplicon

Caséine αs1 Forward TCC ACT AGG CAC ACA ATA CAC TGA 61 nt

(CSN1S1) Reverse GCC AAT GGG ATT AGG GAT GTC

Caséine κ Forward AGG TGC AAT GAT GAA GAG TTT TTT C 66 nt (CSN3) Reverse CCC AAA AAT GGC AGG GTT AA

DGAT1 Forward GGC GGT CCC CAA CCA 58 nt

Reverse GCA GGA GTG GAA GAG CCA GTA Cyclophiline Forward TGA CTT CAC ACG CCA TAA TGG T

Reverse CAT CAT CAA ATT TCT CGC CAT AGA

Protéine ribosomale 24S Forward TTT GCC AGC ACC AAC GTT G 66 nt

Reverse AAG GAA CGC AAG AAC AGA ATG AA