7.1. Séparation par chromatographie gazeuse
La chromatographie gazeuse est la technique la plus largement répandue pour l’analyse des métabolites [68]. Elle permet l’analyse d’échantillons se trouvant en phase gazeuse ou liquide par un processus de chauffage extrêmement rapide qui va mener à la vaporisation de l’échantillon. La rétention de l’analyte est corrélée à son affinité avec la phase stationnaire, qui peut être de polarité différente, ainsi qu’à sa pression de vapeur [69]. La chromatographie en phase gazeuse est une technique rapide, robuste, ayant une grande efficacité en termes de plateaux théoriques (N élevé). De plus, elle peut être couplée avec l’impact électronique qui est une source hautement reproductible, et produisant des ions fragments facilement identifiables [63].
Le principal désavantage de cette technique est l’utilisation d’agents de dérivatisation tels que le MSTFA ou le BSTFA afin de rendre volatils et stables thermiquement des composés qui le sont peu ou pas [10, 70]. Cette étape peut avoir pour effet d’introduire des contaminants provenant des réactifs et provoquant des interférences lors des analyses. Ceci amène en outre une étape supplémentaire lors de la préparation d’échantillon.
Pour l’analyse des composés polaires et non volatils il semble donc plus approprié de choisir des techniques comme la chromatographie en phase liquide, l’électrophorèse capillaire ou encore la chromatographie en phase supercritique [71].
7.2. Séparation par chromatographie liquide
Il existe de nombreux types d’interactions physico-chimiques en chromatographie en phase liquide (LC) qui dépendent du mode chromatographique utilisé ainsi que des analytes. Ces interactions sont résumées dans la figure suivante. Trois modes LC complémentaires, utilisés lors de cette thèse sont abordés dans ce chapitre : la chromatographie liquide à polarité de phase inversée (RPLC), la chromatographie d’interactions hydrophiles (HILIC) ainsi que la chromatographie liquide par paire d’ions (IPC).
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Figure 17: Type d'interactions entre l'analyte, la phase mobile et la phase stationnaire en chromatographie liquide tiré de [72] avec autorisation
Chromatographie liquide en phase inversée (RPLC)
La chromatographie liquide en phase inversée est la plus couramment utilisée pour les analyses métabolomiques [19]. Elle permet de séparer les composés apolaires à moyennement polaires [19]. La phase stationnaire est composée de silice greffée par des groupements alkyl hydrophobes (C4, C8, C18 par exemple) et d’une phase mobile hydro-organique. Les métabolites polaires sont peu retenus avec de telles phases, c’est pourquoi d’autres groupements polaires tels que les carbamates ou amides sont ajoutés, soit à la base du greffon soit à la surface de la silice [73-75]. Ces phases stationnaires modifiées sont cependant spécifiques à certaines catégories de métabolites. Elles peuvent
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donc être adaptées lors d’analyses métabolomiques ciblées mais ne représentent cependant pas un choix adéquat lors d’analyses métabolomiques globales non ciblées.
Chromatographie liquide d’interactions hydrophiles (HILIC)
L’acronyme HILIC a été introduit en 1990 par Alpert [76]. La HILIC comporte l’utilisation d’une phase stationnaire polaire corrélée à une phase mobile de type hydro-organique composée majoritairement de solvant aprotique miscible à l’eau (généralement l’acétonitrile).. Les principaux mécanismes de rétention identifiés sont : a) le partage hydrophile de l’analyte entre la couche d’eau à la surface de la phase stationnaire et la phase mobile riche en acétonitrile b) les interactions électrostatiques, et c) les liaisons hydrogènes (figure 18) [76, 77]. Les matrices biologiques telles que l’urine sont souvent aqueuses et donc les métabolites ont des propriétés principalement polaires. C’est pourquoi l’utilisation de la HILIC semble tout à fait adaptée à cette problématique [78].
Figure 18: Représentation schématique des processus de rétention d’une phase stationnaire sulfoalkylbetaine zwitterionique. Adapté de « A Practical Guide to HILIC, Including ZIC®-HILIC applications » Merck
La phase stationnaire est de la silice vierge ou greffée de groupements polaires tels qu’amine, amide ou diol. La HILIC se différencie de la chromatographie liquide des phases normales (NPLC) par la phase mobile employée. En effet, les phases mobiles utilisées en HILIC sont proches en termes de polarité (phase organique comme l’acétonitrile) de celles utilisées en chromatographie en phase inverse (figure 19) [71]. Le pourcentage de phase aqueuse varie entre 3 et 40%. L’augmentation de la phase aqueuse permet l’élution des composés hydrophiles.
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Figure 19: Mécanismes en HILIC provenant des trois principales méthodes de chromatographie liquide, adapté de [72] avec autorisation
Chromatographie liquide par paire d’ions (IPC)
La chromatographie par paire d’ions est une technique qui date des années 1970 avec l’utilisation de la chromatographie liquide en phase inverse. Il est recherché alors des composés ioniques pouvant être compatibles avec la RPLC, et qui augmentent la capacité de rétention du système et des analytes chargés de façon opposée [79]. La chromatographie par paire d’ions repose principalement sur l’utilisation de colonnes C18 et C8 traditionnellement utilisées en RPLC [80]. Les agents de paire d’ions vont avoir un équilibre entre la surface de la phase stationnaire et l’analyte.
L’utilisation d’un agent de paire d’ions va dépendre de l’analyte et devra être adapté du point de vue physicochimique à celui-ci. Les agents de paire d’ions typiques sont des alkyl sulfonate ou alkyl ammonium. Cependant ces composés tendent à être retenus de façon quasi permanente à la phase stationnaire, et il devient très difficile dès lors de retrouver les conditions de départ dans lesquelles la colonne chromatographique se trouvait avant l’utilisation de ces composés [79]. De plus les agents de paire d’ions ayant de longues chaînes alkyles, ne sont pas compatibles avec la spectrométrie de masse car ils sont peu volatils [79]. Le couplage avec la spectrométrie de masse reste sensible et utilisé avec précaution car les agents de paire d’ions principalement peu volatils peuvent polluer la source d’ionisation et modifier l’intensité du signal. Il semble cependant que l’orientation des sprays dans la source a une influence ( Z-spray < orthogonal spray < linear spray Z, [81]) Les sprays en Z sont moins touchés par cette problématique que les sprays linéaires . Enfin, les agents de paire d’ions peuvent perturber le processus menant à la vaporisation et à la formation d’ions dans la source due à la formation de liaisons entre l’analyte et
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celui-ci [82]. En effet, ils peuvent provoquer une suppression ionique préjudiciable à la sensibilité de la méthode [83].
Toutefois, la RPLC utilisée avec des agents de paire d’ions a été démontrée comme étant une méthode de séparation adaptée à l’analyse d’une large gamme de métabolites polaires chargés négativement ou positivement tels que les nucléotides, les sucres avec un groupement phosphate ou encore les acides carboxyliques [84-90] .L’utilisation de la chromatographie liquide additionnée d’un agent de paire d’ions permet d’augmenter la rétention des composés organiques polaires, tout en étant compatible avec des composés apolaires. Cependant, des problèmes liés à la sensibilité peuvent apparaître en diminuant l’intensité du signal MS. Le gain de rétention apporté par cette approche, en évitant au composé de se retrouver dans le temps mort (où la compétition d’ionisation est importante), peut être diminué par le fait que la capacité d’ionisation est diminuée.
7.3. Chromatographie en phase supercritique (SFC)
La SFC est une technique qui été rapportée la première fois par Klesper et al. [91, 92].
Cette technique est utilisée pour la détection de composés pharmaceutiques et de leurs éventuels métabolites, ainsi que pour des composés majoritairement apolaires, mais reste cependant peu utilisée pour la détection de composés endogènes polaires. [91, 93-95]. On utilise un gaz (principalement le CO2), qui se trouve sous forme liquide à des conditions de températures et de pression données. Tout d’abord, les composés polaires sont couramment solubilisés dans des mélanges méthanol-eau avec parfois de l’acide chlorhydrique ou alors de l’hydroxyde de sodium, ce qui peut se révéler compliqué pour les analyses ultérieures, car la SFC ne tolère qu’un faible pourcentage d’eau. Ensuite, ceux-ci ont une mauvaise solubilité dans le CO2, qui est faiblement polaire par son absence de moment dipolaire. Il est possible d’ajouter un solvant polaire tel que le méthanol (MeOH), l’éthanol (EtOH) ou encore l’isopropanol (IprOH) mais la séparation des composés sera alors bien plus influencée par ces solvants que par la pression ou la densité [96-99].