L’ensemble des logiciels ABSciex utilisés pour de cette thèse est brièvement introduit dans cette partie. Il est important de noter la complémentarité de ces outils. L’information contenue dans un fichier d’acquisition est maintenue au travers de tous ces logiciels. Il est aussi à tout moment possible d’accéder aux données de base et de vérifier la conformité des résultats. Bien que payants, ces logiciels sont des outils extrêmement performants et adaptés aux modes d’acquisition particuliers (notamment le SWATH). En effet, peu de logiciels sont capables de traiter des données SWATH.
10.1. PeakView
Le logiciel PeakView est un outil permettant la visualisation des chromatogrammes et des spectres ainsi que le traitement de ceux-ci. C’est un logiciel de base dans le traitement des données acquises à l’aide d’un instrument ABSciex et duquel il est possible de basculer vers l’utilisation d’autres logiciels (plug-in) comme FormulaFinder pour la recherche de la formule élémentaire. C’est au travers de ce logiciel qu’opère MasterView.
- 47 - 10.2. MasterView
Masterview est utilisé pour l’identification de variables (au travers de l’extraction du courant ionique total d’une espèce m/z). Les spectres MS/MS de ces variables sont comparés à la base de données annotée présente dans le logiciel LibraryView (voir point 10.3). Une recherche de formule chimique des espèces extraites peut être réalisée. Les paramètres de recherches se font selon trois axes.
Tout d’abord, les paramètres d’extraction des signaux sont définis. Il est possible de réaliser une recherche non-ciblée avec une sensibilité plus ou moins fine de détection.
Cela demande cependant un temps de recherche beaucoup plus long. La recherche de formules selon une certaine tolérance de masse suivant l’instrument utilisé ainsi que les éléments chimiques sont des paramètres pour la recherche de formule moléculaire. Celle-ci tient en outre compte des isotopes dans le calcul de la formule moléculaire. Dans le cas d’acquisition SWATH, cette recherche est effectuée sur le spectre TOF-MS. Ces paramètres sont décrits dans la figure suivante.
Figure 26: Paramètres "calculation" de recherche du logiciel MasterView
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La recherche librairie peut se faire selon trois algorithmes (figure 27). Il y a principalement la recherche de confirmation et la recherche de candidats. La recherche de confirmation va comparer la liste exacte utilisée pour la comparaison à la librairie. S’il existe une différence entre le composé recherché et la proposition de la librairie, celui-ci ne sera pas retenu. Par contre, lors de la recherche de candidats, la recherche n’est pas contrainte au composé recherché et la recherche peut proposer des candidats alternatifs. Les résultats peuvent ensuite être classés de plusieurs façons. Les spectres sont comparés soit en
« fit », « reversed fit » ou « purity ».
Avec le paramètre « fit », le score est obtenu grâce à la comparaison du spectre expérimental avec le spectre théorique. Si le spectre expérimental contient plus de fragments que le spectre théorique, le score sera bon car ce sont les pics appartenant au spectre expérimental qui sont contraignants. Ce mode est particulièrement adapté aux anaylses SWATH, car celles-ci contiennent des fragments appartenant à d’autres molécules. En ce qui concerne le mode « reversed fit » ce sont les fragments présents dans le spectre expérimental qui doivent correspondre au spectre théorique. Enfin, la sélection selon le mode « pureté » est la combinaison exacte entre les pics présents dans le spectre théorique et expérimental.
Figure 27: Paramètres "library searching" de recherche du logiciel MasterView
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Enfin, les paramètres de confiance sont intégrés dans l’algorithme de recherche afin de catégoriser les identifications selon l’erreur de masse (en ppm), l’erreur sur le temps de rétention (si spécifié et connu), la différence de ratio des isotopes, le score de la librairie, et enfin la recherche de formule. Le score obtenu est une combinaison de ces différents paramètres qui peuvent être pondérés de façon différente (figure 28).
Figure 28: Paramètres "confidence searching" de recherche du logiciel MasterView
La ligne comprenant le métabolite avec le score déterminé précédemment est sélectionnée (A) (figure 29). La trace chromatographique de ce composé est extraite selon sa masse dans l’expérience TOF-MS, et la ligne rose représente le temps de rétention du chromatogramme où le spectre de l’expérience MS/MS est utilisé pour une comparaison avec le spectre de référence présent dans la librairie (B). Les isotopes sont présentés en C. C’est la comparaison entre la masse exacte et le ratio des aires des isotopes qui y est illustrée. Enfin, le spectre de référence provenant de la librairie et le spectre expérimental sont comparés (D).
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Figure 29: Résultats d'une recherche avec le logiciel MasterView
10.3. LibraryView
Le logiciel LibraryView est composé de spectres expérimentaux qui ont été annotés et dont les isotopes ont été supprimés. Cette librairie annotée (avec 532 métabolites faisant partie de HMDB) a été développée avec des standards dans le cadre d’une thèse précédente [115]. Le cas de l’acide citrique est présenté dans la figure ci-dessous.
Figure 30: Recherche dans le logiciel LibraryView de l'acide citrique
- 51 - methodologies. Biotechnol. Lett., 2007. 29(1): p. 1-16.
4. Tweeddale, H., L. Notley-McRobb, and T. Ferenci, Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis. J. Bacteriol., 1998. 180(19): p. 5109-5116.
5. Kell, D.B. and S.G. Oliver, The metabolome 18 years on: a concept comes of age.
Metabolomics, 2016. 12(10): p. 1-8.
6. Fiehn, O., Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol.
Biol., 2002. 48(1-2): p. 155-171.
7. Dunn, W.B. and D.I. Ellis, Metabolomics: Current analytical platforms and methodologies. TrAC, Trends Anal. Chem., 2005. 24(4): p. 285-294.
8. Dettmer, K., P.A. Aronov, and B.D. Hammock, Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom. Rev., 2007. 26(1): p. 51-78.
9. Fernie, A.R., et al., Innovation: Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2004. 5(9): p. 763-769.
10. Alvarez-Sanchez, B., F. Priego-Capote, and M.D. Luque de Castro, Metabolomics analysis II. Preparation of biological samples prior to detection. TrAC, Trends Anal.
Chem., 2010. 29(2): p. 120-127.
11. Ivanisevic, J., et al., Toward 'Omic Scale Metabolite Profiling: A Dual Separation-Mass Spectrometry Approach for Coverage of Lipid and Central Carbon Metabolism. Anal. Chem. (Washington, DC, U. S.), 2013. 85(14): p. 6876-6884.
12. Bundy, J.G., M.P. Davey, and M.R. Viant, Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics, 2009. 5(1): p. 3-21.
13. Athersuch, T.J. and H.C. Keun, Metabolic profiling in human exposome studies.
Mutagenesis, 2015. 30(6): p. 755-762.
14. Rappaport, S.M., et al., The blood exposome and its role in discovering causes of disease. Environ. Health Perspect., 2014. 122(8): p. 769-774, 6 pp.
15. Saito, K., et al., Differences in metabolite profiles between blood matrices, ages, and sexes among Caucasian individuals and their inter-individual variations.
Metabolomics, 2014. 10(3): p. 402-413.
16. Alvarez-Sanchez, B., F. Priego-Capote, and M.D. Luque de Castro, Metabolomics analysis I. Selection of biological samples and practical aspects preceding sample preparation. TrAC, Trends Anal. Chem., 2010. 29(2): p. 111-119.
17. van der Greef, J., et al., Looking back into the future: 30 years of metabolomics at TNO. Mass Spectrom. Rev., 2013. 32(5): p. 399-415.
18. Wolfender, J.-L., et al., Current approaches and challenges for the metabolite profiling of complex natural extracts. J. Chromatogr. A, 2015. 1382: p. 136-164.
19. Theodoridis, G., H.G. Gika, and I.D. Wilson, LC-MS-based methodology for global metabolite profiling in metabonomics/metabolomics. TrAC, Trends Anal. Chem., 2008. 27(3): p. 251-260.
20. Cajka, T. and O. Fiehn, Toward Merging Untargeted and Targeted Methods in Mass Spectrometry-Based Metabolomics and Lipidomics. Anal. Chem. (Washington, DC, U. S.), 2015: p. Ahead of Print.