Techniques moléculaires : Le génotypage

Le génotypage par biologie moléculaire impose d'effectuer au préalable une transcription inverse et une amplification génique. (RT-PCR)

Il existe deux types de techniques différentes pour la détermination du génotype du VHC, il existe les techniques basées sur le séquençage direct d’une partie du génome et les techniques qui utilisent l’hybridation de sondes spécifiques sur bandelettes, sur puces, sur billes ou par PCR (50).

a) Le séquençage

C’est la technique de référence puisqu’elle consiste en une analyse réelle et intégrale de la séquence de la souche donnée. Basée sur un séquençage direct d’une région du génome après amplification par PCR, on compare ensuite le

résultat obtenu avec une base de données de séquences de génotypes afin de définir la séquence la plus similaire. Le principe de base étant que les zones choisies pour déterminer le génotype doivent être suffisamment conservées mais également suffisamment variables pour pouvoir distinguer les différents sous types et génotypes (50).

Pour déterminer le génotype du VHC, la technique de référence est le séquençage de la région NS5B ou de la région E1 du génome, suivi de l'analyse phylogénique des séquences en comparaison à des séquences de référence. La région NS3 peut aussi être utilisée.

Auparavant en pratique clinique, on déterminait le génotype soit par séquençage direct de la région 5'NC que l'on compare ensuite avec des séquences de référence des bases de données, soit par hybridation inverse de produits de PCR de la région 5'NC à des sondes oligonucléotidiques spécifiques de type ou de sous-type fixées sur des bandelettes de nitrocellulose. Cependant, ces techniques qui reposent sur l'étude de la région 5'NC sont responsables d'erreurs de sous typage de génotype dans environ 20 % des cas. Les nouvelles recommandations déconseillent son utilisation exclusive aboutissant à son abandon (50).

La méthode de Sanger est la plus utilisée pour le séquençage. Le séquençage repose sur le principe d’une PCR suivie d’une électrophorèse capillaire afin de séparer au nucléotide près les différents fragments obtenus (50). La technique utilise l'ADN comme modèle pour générer un ensemble de fragments qui diffèrent entre eux en longueur par une seule base. Les fragments sont ensuite séparés par taille, et les bases à la fin sont identifiées, recréant ainsi la séquence originale de l'ADN (51).

b) Polymorphisme de longueur des fragments de restriction

Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (restriction fragment length polymorphism ou RFLP) consiste à réaliser une amplification par PCR, le plus souvent des régions 5'NC et NS5 du VHC, puis à effectuer une coupure des produits d'amplification à l'aide de plusieurs enzymes de restriction. Un choix adéquat d'enzymes permet d'obtenir un polymorphisme de restriction caractéristique de types ou de sous-types du virus (52). Cette méthode est relativement facile à effectuer et peu coûteuse. Néanmoins, elle présente des erreurs d'identification des sous-types du génotype 6 en particulier (53).

c) Hybridation inverse :

L’hybridation inverse en ligne ou line probe assay (LIPA)

Actuellement, une nouvelle méthode (VERSANT® HCV Genotype 2.0 (LiPa)) qui analyse à la fois la région 5'NC et la région de la capside par hybridation inverse a donné de très bons résultats de sous-typage avec plus que 4 % d'erreurs de sous-types. Elle est fondée sur l’amplification de la région 5'NC du VHC avec des amorces biotinylées (54). Le produit de PCR est hybridé par la suite à une membrane imprégnée avec des sondes de génotypes spécifiques et détecté avec la streptavidine qui est reliée à un détecteur colorimétrique (Figure 14).

Figure 14: Principe de l’hybridation inverse

Il a été noté que les méthodes qui reposent sur l’amplification de la région 5'NC n’identifient pas les génotypes 6C à 6l (54-55). Par ailleurs, le LIPA est incapable de distinguer le génotype 1a du 1b dans 5-10 % des cas (56-57). Afin d'améliorer l'exactitude de la distinction entre les génotypes 1a, 1b et 6c à 6l, une nouvelle génération d’essais d’hybridation inverse en ligne utilisant les informations de séquence CORE en plus de la région 5'NC a été développée. La technique LIPA présente l'avantage d'être une méthode standardisée et rapide. La simplicité de sa mise en œuvre rend son utilisation assez large malgré son coût élevé.

Une deuxième génération de test Inno-LiPa permet une meilleure discrimination des souches de génotype 1a et 1b, ainsi que des souches de génotype 6 par rapport à la première génération (Chevaliez, 2011). Or il est désormais important de distinguer les patients infectés par un génotype 1a des patients infectés par un génotype 1b, car le pronostic n’est pas le même.

En effet, il paraît plus difficile de traiter les patients infectés par un génotype 1a (environ 10 % de RVS en moins) que les patients infectés par un génotype 1b.

d) Spectrométrie de masse : MALDI-TOF

Une des technologies utilisées dans le génotypage du VHC est la spectrométrie de masse. Cette technique utilise la désorption-ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) couplée à un analyseur à temps de vol (TOF). Elle permet d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et sensibles à la chaleur sans les dégrader (Figure 15).

Figure 15: Principe de la technique MALDI-TOF (adapté de (58)

e) PCR en temps réel

La PCR en temps réel est fondée sur la détection et la quantification des produits d’amplification au cours de la réaction. La chimie Taqman est la plus utilisée pour la détermination des génotypes du VHC, grâce à l’utilisation de sondes oligo-nucléotidiques fluorescentes et spécifiques. La région 5'NC est

ciblée pour la classification des génotypes du VHC 1, 2, 3, 4, 5 et 6 et la région NS5B pour les sous-types 1a et 1b (59). Des kits prêts à l’emploi sont commercialisés. Cette technique permet la détermination rapide des génotypes du VHC à un coût réduit, même sur des échantillons faiblement titrés. Toutefois, sa détection pour les sous-types et les nouveaux types reste limitée.

f) Autres techniques :

De nouvelles technologies innovantes Luminex, xMAP utilisent des sondes fixées sur des microparticules.

En conclusion, malgré l’existence de nombreuses techniques la méthode

de référence reste le séquençage direct. Cette méthode s’est révélée être la plus fiable en particulier dans le cas de doute sur la classification ou pour les types viraux peu fréquents. Le typage est indispensable à la prise en charge des patients infectés par le VHC car il conditionne le choix du traitement.

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