I.2.A / La bioluminescence
Les lignées transgéniques dont nous disposons nous permettent de suivre directement les oscillations de l’horloge. Ceci constitue une évolution majeure pour l’étude des horloges puisque leur suivi indirect par le biais de sorties pose la difficulté de faire la part entre l’influence de l’horloge et celle d’éventuelles autres sources qui peuvent provoquer des phénomènes de masquage.
L’enregistrement de la bioluminescence avec le LumiCycle a pour principal avantage de permettre le suivi simultané d’un grand nombre d’échantillons sur le long terme. Le suivi longitudinal d’un même échantillon
avec une fréquence élevée de comptage, outre la diminution des animaux nécessaire à l’étude d’un rythme, permet de révéler plus facilement les rythmes que les techniques de qPCR ou de quantifications diverses. Il donne également accès à des informations plus précises sur les rythmes enregistrés (amplitude, période, persistance). En revanche, cette technique est focalisée sur un unique gène ou une unique protéine et ne permet pas de recueillir en parallèle des informations sur d’autres entités cellulaires. Enfin, elle ne donne pas d’indications sur la localisation intra-tissulaire des rythmes enregistrés. Pour cela, une technique complémentaire est actuellement en cours de développement au laboratoire : c’est un système d’enregistrement de la bioluminescence par caméra, appelé Luminoview (Olympus), qui associe une résolution spatiale à la résolution temporelle du suivi des rythmes.
I.2.B / L’analyse des données de bioluminescence
Nous avons développé une méthode d’analyse qui permet une mesure précise de la période des oscillations, à partir des données brutes. Cette méthode est efficace même sur des oscillations de faible amplitude et dont le tracé est bruité et irrégulier et donne accès à des indices de la qualité de l’ajustement par rapport aux données, mais aussi à l’erreur assortie à la période mesurée. Elle n’est en revanche pas efficace sur des oscillations dont la période varie trop dans l’intervalle de la fenêtre d’analyse, mais dans une telle situation seule une analyse de la période cycle par cycle pourrait aboutir.
Il sera utile de développer à l’avenir des méthodes d’analyse similaires pour l’amplitude, l’amortissement et les acrophases des oscillations afin d’en obtenir des mesures fines pour pouvoir mettre en évidence des effets subtils. L’amplitude moyenne sur plusieurs oscillations et l’amplitude de chaque cycle apportent des informations complémentaires, la première indique un comportement général et met en évidence plutôt des effets durables tandis que la deuxième informe sur la réponse immédiate à une stimulation par exemple. Le taux d’amortissement des oscillations informe sur la robustesse de l’horloge.
I.2.C / La culture
La culture est l’outil idéal pour l’étude des propriétés endogènes d’un tissu, puisqu’il n’y subit pas l’influence des autres tissus, et que les influences du milieu extérieur peuvent être contrôlées (dans la limite des connaissances actuelles). Il est évident que les observations effectuées in vitro ne reflètent pas forcément la réalité de ce qu’il se passe in vivo mais traduisent les potentialités du tissu livré à lui-même dans un contexte particulier (milieu de culture fourni, conditions de culture, …). C’est dans ce cadre notamment qu’il y aura lieu de déterminer si le manque de réactivité à la lumière des rétines que nous avons étudiées est lié à leurs propriétés endogènes ou à un élément non maîtrisé des protocoles expérimentaux.
Le principal inconvénient de notre système expérimental est le fait que le milieu de culture ne peut pas être continuellement renouvelé, et a donc une composition qui évolue au fil du temps de culture. Les échantillons ne sont donc pas exposés à un milieu constant et contrôlé. Le maintien des échantillons peut se faire par un renouvellement régulier du milieu de culture, mais cet événement, qui implique une modification brutale des constituants chimiques avec lesquels le tissu est en contact, mais également une variation transitoire de la température à laquelle il est exposé et une exposition à de la lumière rouge, induit forcément des réponses cellulaires qui peuvent interférer avec l’horloge. Pour cette raison, il est prévu d’associer aux enregistrements avec le Luminoview un système de renouvellement permanent du milieu de culture.
I.2.D / La coupe au vibratome
L’extension de la technique de séparation horizontale par un vibratome à l’ensemble des 3 couches rétiniennes est inédite et a permis de franchir un pas important quant à la question de la localisation tissulaire de l’horloge rétinienne. Elle fournit également un outil pour l’étude de ces couches en culture de manière générale. Sa difficulté réside dans le fait qu’elle ne peut que difficilement être standardisée, ce qui en fait une technique de préparation longue et qui n’aboutit pas à des populations complètement homogènes d’échantillons (en termes de pureté, de taille, d’intégrité). Pour ce qui est des couches GCL et PRL, il est possible d’obtenir des échantillons relativement purs, voire complètement purs pour une partie des préparations, mais pour ce qui est de l’INL c’est plus difficile. Comme l’INL et la GCL isolées expriment des rythmes qui ont des propriétés différentes de celles de la rétine entière et de la "double couche" GCL+INL, il est possible d’avoir la certitude qu’elles expriment leur comportement propre tout en ne connaissant pas exactement leur degré de pureté. En ce qui concerne la PRL, c’est la couche qui peut être obtenue avec le plus grand degré de pureté (du fait de l’importance de son épaisseur), comme l’indiquent les résultats de PCR. En revanche, son comportement en bioluminescence ne peut pas être utilisé comme un reflet de sa pureté dans la mesure où la "double couche" PRL+INL a le même comportement. Il serait néanmoins intéressant de réaliser une étude systématique de ces préparations par immunohistochimie car cela compléterait les informations de composition cellulaires réalisées par PCR en indiquant l’étendue de la contamination et leurs positionnements les plus fréquents (ce qui pourrait alors être pris en compte au moment de la préparation des échantillons pour la culture).