1. Construction de vecteurs d’expression des protéines recombinantes
Les régions codantes pour les protéines Tic32, ceQORH, NQR et FSD1 ont été obtenues à partir
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oligonucléotides (Eurofins Genomics) spécifiques. Ces oligonucléotides ont permis d’introduire
les sites de restriction NdeI et XhoI aux extrémités 5’ et 3’ des ADNc codant pour les protéines
Tic32, ceQORH, NQR et FSD1. Les fragments amplifiés ont été insérés par un clonage à bouts francs dans un plasmide intermédiaire, le plasmide pBlueScript (pKS), afin d’être entièrement
séquencés. La digestion de ce plasmide par les enzymes de restriction NdeI et XhoI a permis d’isoler
les inserts afin de vérifier leurs séquences.
La région codante pour la fusion GFP a été obtenue à partir d’amplification par PCR sur le plasmide commercialisé pUC-GFP [135] en utilisant des amorces contenant les sites de restriction
XhoI et BamHI. Le fragment amplifié a été inséré par un clonage à bouts francs dans le plasmide
pKS. La digestion de ce plasmide par les enzymes de restriction XhoI et BamHI a permis d’isoler
l’insert qui code pour la protéine de fusion GFP afin de l’introduire dans le vecteur d’expression. La construction des recombinaisons Tic32::GFP, ceQORH::GFP, NQR::GFP, et FSD1::GFP a été réalisée par clonage à bouts cohésifs, dans le plasmide d’expression pET-20b qui a été
préalablement digéré par NdeI et BamHI pour la forme fusionnée à la séquence poly-histidine.
La souche DH5α a été utilisée pour la production de plasmides recombinants. Cette souche contient
la partie α de la β-galactosidase et permet d'avoir une sélection blanc/bleu avec des plasmides
contenant la partie complémentaire de la β-galactosidase.
2. Préparation de l'ADN plasmidique
a) Minipréparation d'ADN plasmidique
Le kit de minipréparation NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel) a été utilisé. Il repose sur le principe de la lyse alcaline des bactéries suivie d’une purification sur colonne. Les termes mini et midi désignent le volume de départ de la culture bactérienne. Pour une minipréparation, il s’agit de 3 mL de culture bactérienne. Les bactéries recombinantes sont cultivées (sous agitation à 250 rpm, à 37°C) pendant 12 h dans du milieu LB contenant 100 mg/mL de carbénicilline. Le protocole expérimental fourni avec le kit a été suivi à la lettre.
b) Midipréparationd'ADN plasmidique
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de l'ADN plasmidique (pET-20b et pKS) à partir de cultures bactériennes de 50 mL. Toutes les étapes de purification sont réalisées dans les conditions préconisées par le fabriquant.
3. Préparation et transformation des bactéries compétentes
Les bactéries compétentes (c’est à dire aptes à intégrer l’ADN étranger) sont préparées par un
traitement au CaCl2 (Maniatis et al., 1982).
A partir d’une colonie bactérienne isolée sur boite LB agar (Carl Roth), les bactéries (DH5α, ROSETTA) sont cultivées dans 5 mL de milieu LB (250 rpm, 37°C) pendant la nuit, suivie d’une dilution au 1:100 dans 500 mL de milieu LB (250 rpm, 37°C) jusqu’à une absorbance à 600 nm de 0,5 à 0,6. Les bactéries sont ensuite centrifugées 10 min à 4000 g (SLA 3000) et remises en suspension dans 100 mL de MgCl2 100 mM froid. Après 20 à 30 min dans la glace, une nouvelle
centrifugation de 10 min à 4000 g a été réalisée, le culot de bactéries est repris dans 10 mL de
CaCl2 100 mM froid. A ce stade, les cellules sont considérées comme compétentes. Des aliquotes de 50 µL ont été préparés et immédiatement congelés dans l’azote liquide puis stockés à -80°C. Les plasmides (environ 100 ng) sont mélangés à 100 µL de bactéries compétentes pendant 25 min dans la glace. Un choc thermique de 1,5 min à 42°C permet la transformation des bactéries par les plasmides. La suspension bactérienne est alors incubée 1 h (250 rpm, 37°C) dans 0,6 mL de milieu LB, puis étalée sur boîte de Pétri contenant du milieu LB et de la carbénicilline (concentration finale : 100 mg/mL). Dans ces conditions, seules les bactéries ayant incorporé un plasmide se multiplient.
4. Conditions d’expression
Les bactéries recombinantes (ROSETTA) sont mises en culture dans du milieu LB à 37°C jusqu’à ce que l’absorbance à 600 nm soit comprise entre 0,4 et 0,8. L’induction de la synthèse de la protéine recombinante (Tic32::GFP, ceQORH::GFP, NQR::GFP, et FSD1::GFP) est déclenchée par ajout d'IPTG 1mM. Lorsque la protéine synthétisée est insoluble (corps d'inclusion) en condition standard, diverses conditions d'induction sont testées. Ces conditions incluent des variations de température (18, 30, 37 et 42°C), diverses concentrations d'IPTG (0, 0,1 et 0,4 mM) et des durées d'induction variables.
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5. Vérification de la solubilité des protéines
Après induction de l’expression dans les bactéries ROSETTA et avant purification, une étape de vérification de la solubilité de toutes les protéines recombinantes (Tic32::GFP, ceQORH::GFP, NQR::GFP, et FSD1::GFP) a été réalisée. Diverses conditions d'induction sont testées. Au temps
optimal déterminé pour l'expression, la suspension de cellules est centrifugée 20 min à 180 g. Le
culot de cellules est remis en suspension dans un tampon contenant (Tris/HCl 20 mM pH 7,9, imidazole 5 mM, NaCl 0,5 M) et lysé pendant trois cycles successifs de sonication à 0°C (120 V, 1 min) afin de casser la totalité des cellules.
Cette suspension est ensuite centrifugée 40 min à 16000 g afin de distinguer une fraction
membranaire et une fraction soluble. Les deux fractions sont ensuite analysées par électrophorèse en conditions dénaturantes et par marquage immunologique.
6. Technique de purification des protéines recombinantes contenant une
extension C-terminale poly-histidine
Les protéines recombinantes exprimées sous forme de fusion avec une séquence polyhistidine en
C-terminal peuvent être purifiées par chromatographie d’affinité. En effet, lorsque les histidines
sont déprotonées à pH 7,9, la séquence poly-histidine se lie, avec une forte affinité, aux cations
bivalents (Ni2+) immobilisés sur des colonnes de chélation des métaux.
Les protéines non fixées sont alors éliminées par des lavages successifs et la protéine étiquetée est éluée de la colonne par des tampons contenant des concentrations croissantes d’imidazole.
a) Préparation des protéines
Un culot de bactéries contenant la protéine recombinante conservé à -80°C (correspondant à 500 mL de culture induite) est dilué dans du tampon de fixation froid (Tris/HCl 20 mM pH 7,9, imidazole 5 mM, NaCl 0,5 M) (30 mL de tampon pour 500 mL de culture bactérienne). Les bactéries sont lysées et leur ADN est détruit par des cycles successifs de sonication à 0°C (120 V, 1 min). La sonication est poursuivie jusqu’à ce que le milieu devienne limpide. Le lysat est ensuite
centrifugé à 39000 g pendant 40 min à 4°C (Sorvall RC-5, rotor SS34) afin d’éliminer les débris
cellulaires. Le surnageant qui contient les protéines solubilisées est immédiatement déposé sur la colonne d’affinité.
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b) Préparation de la colonne
La matrice (Novagen) est rincée dans 3 volumes (volume de colonne) d’eau, chargée en nickel par 5 volumes de tampon de charge (NiSO4 50 mM) et équilibrée par 3 volumes de tampon de fixation (Tris/HCl 20 mM pH 7,9, imidazole 5 mM, NaCl 0,5 M).
c) Chromatographie d'affinité
L'échantillon protéique est déposé sur la matrice, le débit utilisé est de l'ordre de 10 volumes de
colonne/h. Les protéines peu ou non affines pour les ions Ni2+ sont éluées par des concentrations
croissantes d’imidazole allant de 20 mM à 50 mM. La colonne est lavée successivement par 10 volumes de tampon de fixation, puis 10 volumes de tampon de lavage (Tris/HCl 20 mM pH 7,9, imidazole 60 mM, NaCl 0,5 M). L’élution s’effectue par addition de 6 volumes de tampon d’élution (Tris/HCl 20 mM pH 7,9, imidazole 1 M, NaCl 0,5 M). Les fractions d'élution sont collectées (0,2 mL par fraction). Les protéines contenues dans les différentes fractions sont ensuite analysées par électrophorèse en conditions dénaturantes et par marquage immunologique.