L’objectif de mon projet de thèse était d’identifier des composants des systèmes d’import alternatifs de protéines chloroplastiques « non canoniques » (indépendants des systèmes TIC/TOC), dont l’existence a été mise en évidence par notre équipe dès 2007. Deux stratégies ont alors été envisagées.
Une approche directe (biochimie) qui reposait sur des techniques biochimiques combinant le pontage chimique, la purification par affinité et la spectrométrie de masse. Cette stratégie avait pour objectif d’identifier des récepteurs d’import localisés à la surface des chloroplastes et requis pour l’import de protéines contenant des peptides de transit non canoniques et étude de leur rôle dans le contrôle de la physiologie de la plante.
Une approche alternative (gènes candidats) qui portait sur la bio-analyse du protéome de l’enveloppe du chloroplaste et qui impliquait de revisiter la composition du protéome de l’enveloppe du chloroplaste à l’aide d’approches nouvelles reposant sur la quantification des protéines grâce à une plus grande sensibilité des équipements actuels, et a été étendu à identifier des nouveaux mécanismes moléculaires qui pourraient être impliqués dans le contrôle de la localisation cellulaire des protéines des plastes adressées à plusieurs compartiments sub-cellulaires.
Le premier volet de mon travail (chapitre I) a été consacré à l’identification des candidats récepteurs à la surface des chloroplastes qui sont nécessaires pour l'import des protéines chloroplastiques contenant des peptides de transit non canoniques. Pendant la première année de thèse, j’ai réussi à produire les protéines chloroplastiques contenant des peptides de transit non canoniques (Tic32, FSD1, ceQORH et NQR). Ces protéines ont ensuite été utilisées comme appâts dans les études d'interaction protéine/récepteur. Ensuite, après optimisation et expérimentations préliminaires, une purification par affinité des récepteurs d'import (complexes générés par la réaction de pontage chimique) a été réalisée. Une approche reposant sur de la spectrométrie de masse quantitative a été ensuite adoptée afin d'identifier des peptides de récepteurs spécifiquement enrichis dans les fractions éluées à partir de la matrice d'affinité. Après traitement de données protéomiques générées par la spectrométrie de masse, plusieurs candidats « partenaires » ont été identifiés.
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La deuxième année de thèse a été donc principalement consacrée à la validation in planta de la
nature de ces candidats sélectionnés (issus de la réaction de pontage) par étude de l’impact des mutations sur la localisation sub-cellulaire des protéines étudiées (Tic32, FSD1, ceQORH et NQR) par microscopie confocale. Pour cela, des lignées d'insertions d'Arabidopsis affectées dans l'expression de ces récepteurs putatifs ont été isolées. Les mutants homozygotes ont été ensuite transformés par les versions étiquetées par la protéine GFP des protéines chloroplastiques non canoniques correspondantes, afin de valider l’implication effective des candidats récepteurs identifiés dans le contrôle de l’adressage alternatif des protéines au chloroplaste en étudiant l’impact de ces mutations sur la localisation sub-cellulaire des protéines étudiées par microscopie confocale. Il s’est avéré que, parmi tous les candidats sélectionnés et déjà analysés, une protéine désignée « ClpD » avait un impact sur la localisation de la protéine ceQORH. La troisième année de thèse a été donc principalement consacrée à la validation du rôle de cette protéine « ClpD » sur la physiologie de la plante par des analyses phénotypiques sur le mutant correspondant. Cette étude sera suivie par l’application d’approches de protéomique différentielle à l’échelle du chloroplaste entier de plantes WT versus des mutants (∆ClpD) visant à déchiffrer la nature des protéines dont les niveaux d’équilibre seront affectés chez le mutant par rapport au WT.
Des échantillons d’enveloppe sans pontage chimique ont été aussi analysés (qui ont servi pour contrôles). En conséquence, en parallèle à la recherche des récepteurs potentiels par l’approche du pontage chimique, les études protéomiques réalisées ont également généré une masse de données originales qui permettaient d’avoir une vision quantitative de la composition protéique de l’enveloppe des chloroplastes.
Le deuxième volet de mon travail (chapitre II) portait ainsi sur la mise à jour de la composition du
protéome de l’enveloppe du chloroplaste en reposant sur i) l’enrichissement des protéines dans des
fractions purifiées de l’enveloppe des chloroplastes par rapport à l’extrait cellulaire total et ii) sur
la sensibilité accrue des appareils de détection. Ces travaux ont permis de compléter les bases de données actuelles et mettre en évidence un grand nombre de protéines qui semblent partagées entre l’enveloppe du chloroplaste, le réticulum endoplasmique et le Golgi. Ces dernières pourraient être impliquées dans des interactions entre ces divers compartiments cellulaires ouvrant des pistes de recherche très intéressantes.
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Sur la base de ce protéome revisité, a été initiée une bioanalyse de l’enveloppe du chloroplaste afin d’identifier des nouvelles protéines mineures spécifiques de l’enveloppe et qui pourraient être compatibles avec un rôle de récepteurs d’import des protéines non canoniques des chloroplastes. Cette approche est encore en cours.
Le troisième volet de mon travail (chapitre III) concerne mon implication, sur les deux dernières années de ma thèse, dans un autre projet de l’équipe qui cible toujours sur le contrôle de l’adressage des protéines au chloroplaste. Comme évoqué ci-dessus (section III.1.a), depuis plusieurs année l’équipe étudie une protéine chloroplastique très originale : la protéine ceQORH. Cette protéine est multilocalisée notamment dans les cellules de l’épiderme de la feuille où la protéine est essentiellement localisée dans la membrane plasmique. Afin d’expliquer la localisation sub-cellulaire variable de la protéine ceQORH, les membres de l’équipe avaient émis l’hypothèse d’une interaction probable de cette protéine ceQORH avec un partenaire cytosolique. Ils ont ensuite
validé l’interaction, in planta, de la protéine chloroplastique ceQORH avec cette protéine
cytosolique, une calmoduline, puis déterminé le domaine de la protéine ceQORH qui est responsable de l’interaction avec cette calmoduline. La construction d’une version mutée (« Mut2») de la protéine ceQORH n’interagissant plus avec la calmoduline leur a ensuite permis
de démontrer in planta le rôle direct de cette interaction dans le contrôle de l’adressage de ceQORH
aux chloroplastes.
Ma participation à ce projet a reposé sur une approche de génétique inverse qui a consisté à confirmer l’identité de l’isoforme de calmoduline impliquée dans ce mécanisme. Pour ce faire, j’ai isolé un mutant KO d'Arabidopsis affecté dans l'expression de cette isoforme. Le mutant
homozygote (cam5) a été ensuite transformé par les versions étiquetées par la protéine GFP des
protéines ceQORH sauvage et ceQORH mutée (Mut2, qui ne lie plus la calmoduline) et la localisation de ces protéines de fusion a été visualisée par microscopie confocale. Ces expériences
ont permis de confirmer que c’est bien le produit du gène cam5 qui régule la localisation
Matériel et méthodes
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