Les techniques d’empreintes moléculaires

Les techniques d’empreintes moléculaires sont des techniques de biologie moléculaire utilisées pour caractériser la structure de la communauté microbienne présente dans un environnement donné. Elles sont basées sur l’analyse directe des produits de l’amplification d’un gène marqueur, après séparation suivant leurs tailles ou leur polymorphisme de séquence par migration sur un gel d’agarose ou de polyacrylamide, par exemple. Le gène marqueur le plus couramment utilisé dans ce cas, est le gène codant pour la petite sous-unité ribosomique. Les techniques d’empreintes moléculaire regroupent par exemple les techniques d’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant ou électrophorèse sur gel en gradient de température (DGGE/TGGE, denaturing gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis), de polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux ou non (T-RFLP, terminal restriction fragment length polymorphism ; RFLP, restriction fragment length polymorphism), d’analyse des fragments de restriction de l’ADN ribosomique (ARDRA, amplified ribosomal DNA restriction analysis), ou encore d’analyse du polymorphisme de conformation des simples brins d’ADN (SSCP, single strand conformation polymorphism). D’autres techniques, comme l’analyse de l’espace intergénique ribosomique (RISA, ribosomal intergenic spacer analysis) et l’analyse automatique de l’espace intergénique ribosomique (ARISA, automated ribosomal intergenic spacer analysis) ciblent quant à elles l’intergène ribosomique. Ces différentes techniques ont l’avantage d’être rapide et de permettre l’analyse d’un grand nombre d’échantillons de façon simultanée (Ranjard et al., 2000b ; Rastogi et Sani, 2011). Cependant, la taxonomie des microorganismes d’un milieu ne peut pas être précisée par ces techniques : elles ne permettent que de comparer la structure génétique de différentes communautés microbiennes, au cours du temps ou en fonction d’autres facteurs. Par conséquent et dans le but d’avoir également accès aux informations taxonomiques, les techniques d’empreintes moléculaires peuvent être complémentées par la création d’une banque de clones, par exemple.

Une des techniques d’analyse des communautés microbiennes par empreintes moléculaires utilisée dans de nombreuses études et pour de nombreux types d’environnements différents est la T-RFLP (Lukow et al., 2000 ; Braker et al., 2001 ; Collins et al., 2003 ; Egert et al., 2003 ; Wang et al., 2004b ; Smalla et al., 2007 ; Tipayno et al., 2012 ; Pervin et al., 2013). Cette technique est basée sur l’amplification du gène marqueur par PCR en utilisant des amorces spécifiques, dont une est marquée à son extrémité 5’ par un fluorochrome. Une fois la partie du gène d’intérêt amplifiée et donc marquée par le fluorochrome, les produits PCR sont digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction, avant que la taille des produits de digestion marqués ainsi que leur relative abondance (basé sur l’intensité de la fluorescence) ne soient déterminées par l’intermédiaire d’un séquenceur capillaire de type Sanger (Sanger

et al., 1977). La Figure 1.10 résume les différentes étapes de la T-RFLP.

Figure 1.10 - Principe de la T-RFLP

Bien que cette technique permette d’avoir un aperçu rapide de la structure génétique des communautés microbiennes d’un grand nombre d’échantillons, ou encore qu’elle soit hautement reproductible (Osborn et al., 2000), une de ses principales limites est le seuil de détection : seules les populations microbiennes dominantes d’une communauté peuvent être facilement détectées. D’autres populations générant des signaux de fluorescence faibles ne pourront être distinguées du bruit de fond et ne pourront donc pas être prises en compte dans l’estimation de la diversité (Bent et Forney, 2008). De même, il a été démontré que plusieurs séquences partageant un même site de restriction peuvent partager le même signal final et ne pourront pas, en conséquence, être différenciées (Nocker et al., 2007). Enfin, cette technique

ne permet pas une identification rapide des populations microbiennes. En effet, il est possible de déduire la composition de la communauté étudiée par la taille des fragments de restriction générés en comparant les résultats de T-RFLP obtenus à des bases de données regroupant les différentes tailles de fragments qu’il est possible d’obtenir, suivant les enzymes de restriction utilisées et ceci pour différentes espèces de bactéries et d’archées. Cependant, pour un même produit de digestion, cette technique d’identification donne souvent plusieurs origines possibles, ce qui rend difficile, voire impossible, une bonne identification. La réalisation de banque de clones est alors la seconde méthode permettant d’identifier l’origine des produits de digestion marqués. Or, comme décrit précédemment (II.2.1.2), cette technique est fastidieuse (Rittmann et al., 2008) et nécessite de maitriser un grand nombre de techniques de microbiologie et biologie moléculaire.

La DGGE et la TGGE permettent de pallier à la limitation de la T-RFLP concernant l’identification rapide des populations microbiennes, par l’accès direct, après excision du gel, aux bandes d’ADN analysées, permettant ainsi leurs séquençages et leurs identifications (Ranjard et al., 2000b ; Kirk et al., 2004). En effet, la DGGE et la TGGE sont toutes deux basées sur la séparation des produits d’amplification du gène marqueur par électrophorèse sur gel d’acrylamide, sous conditions de gradient dénaturant (par l’utilisation de formamide ou d’urée dans le cas de la DGGE) ou de température (cas de la TGGE). Afin d’éviter l’élution des produits d’amplification du gel lors de la migration, une structure d’environ 40 pb riche en nucléotides guanine et cytosine (GC) portée à l’extrémité 5’ d’une des deux amorces est ajoutée aux fragments d’ADN amplifiés lors de la PCR (Myers et al., 1985). Du fait que les produits PCR résultant de l’amplification ont tous plus ou moins la même taille, ce sont les propriétés de ces fragments et notamment leur contenu en base G et C qui vont déterminer leur comportement migratoire et donc permettre leur séparation en fonction du gradient dénaturant. La Figure 1.11 présente les étapes clés de la DGGE.

Figure 1.11 - Les étapes clés de la DGGE

En plus de permettre une identification assez rapide des fragments d’ADN, ces techniques ont également l’avantage de permettre une discrimination théorique entre deux fragments d’ADN ayant une différence minimum d’un nucléotide (Nocker et al., 2007). Cependant, elles sont difficiles à reproduire et une même espèce peut générer plusieurs bandes d’ADN sur le gel du fait de micro variation dans la séquence d’ADN (Kirk et al., 2004 ; Nocker et al., 2007).

La technique RISA permet quant à elle l’analyse de la région intergénique ribosomique après amplification par PCR puis migration sur gel d’acrylamide. Sa version automatisée (ARISA), consiste, quant à elle, en l’utilisation d’amorces PCR forward marquées (fluorescence) qui seront par la suite détectées, après migration, de façon automatique grâce à un laser. Ces deux méthodes d’analyse de l’IGS ribosomique sont jugées hautement reproductibles, cependant elles nécessitent une grande quantité d’ADN microbien au départ et sont longues à mettre en place (Fisher et Triplett, 1999 ; Kirk et al., 2004). Elles permettent également d’obtenir une estimation seulement grossière de la richesse microbienne de l’échantillon étudié (Kovacs et

al., 2010). Pour exemple, les technique RISA et ARISA ont été utilisées pour étudier la structure microbienne du sol (Ranjard et al., 2000a ; Sigler et Zeyer, 2002 ; Khodadad et al., 2011), ainsi qu’en milieu marin (Brown et al., 2005).

Les études notamment de Ranjard et al. (2000b), Kirk et al. (2004), Nocker et al. (2007) et Rincon-Florez et al. (2013) permettent de souligner le fait que chaque technique d’empreinte

Communautés microbiennes de différents échantillons

ADN extrait (par échantillon)

Amplification par PCR du gène marqueur et ajout de la structure

riche en GC (GC clamp) )

Produit PCR

Produit PCR dénaturé

Gène marqueur commun à chaque communauté microbienne étudiée

Gène marqueur propre à une communauté microbienne précise g ra d ie n t d én at u ra n t Un puit = un échantillon

moléculaire a ses propres avantages et inconvénients pour révéler la structure d’une communauté microbienne donnée. Ainsi, le choix de la méthode d’analyse à utiliser dépend entre autre de nombreux facteurs comme la complexité de la communauté microbienne à analyser ainsi que du nombre d’échantillons à analyser.