Techniques d’analyse des huiles essentielles :

Quelque soit le domaine d’utilisation des huiles essentielles (parfumerie, cosmétique, industrie pharmaceutique et agroalimentaire), une parfaite connaissance de leur composition chimique est nécessaire pour en contrôler la qualité et y déceler une éventuelle spécificité en vue de leur valorisation. Ainsi l’analyse des huiles essentielles, qui consiste en des méthodes de séparation et d’identification des composants, reste une étape importante. Cependant, elle demeure une opération délicate nécessitant la mise en œuvre de diverses techniques [35].

1. Chromatographie sur couche mince:

Il s’agit de la première et plus utilisée des techniques chromatographiques, elle fournit des informations simples quant aux caractères physicochimiques des composants d’un mélange. De nombreuses pharmacopées préconisent l’utilisation de cette technique vue sa simplicité pour la caractérisation des huiles essentielles en test de routine.

Les fondements de la CCM appliquée aux huiles essentielles ont été établis par stahl en 1969 [69, 70] et par Geiss en 1987 [71] qui ont étudié un nombre conséquent de métabolites secondaires de plantes aromatiques notamment. Puis en 2003 Shema et Fried [72] ont publié

le « Manuel de la CCM ». D’autres approches de la CCM ont donné naissance à la CCM haute performance puis à la CCM en surpression et à la chromatographie en rotation de phase (RPC) qui sont des techniques de flux forcé.

Cependant cette technique est à indiquer pour la détermination rapide des différentes voies et/ou familles chimiques présentes dans une huile essentielle donnée. Pour donner un exemple Prasard l (1947) a réussi à isoler des hydrocarbures sésquiterpènique en utilisant des couches imprégnées de nitrate d’argent et de perchlorate d’argent. Saritas est allé encore plus loin en isolant individuellement ces sesquiterpènes en 2000 [73].

Elle repose principalement sur des phénomènes d'adsorption. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide en plastique ou en aluminium, les substances migrent, entraînées par la phase mobile composée d’un ou de plusieurs solvants. Ensuite, le repérage des molécules s’effectue soit par ultra-violet (UV), soit par un colorant spécifique ou encore par exposition aux vapeurs d’iode [35].

2. Chromatographie en phase gazeuse:

Il s’agit d’une technique de chimie analytique qui permet de séparer des composés volatils ou volatilisables sans dégradation (non-thermolabiles). Son pouvoir de séparation dépasse celui de toutes les autres techniques, du moins pour les huiles essentielles. Elle permet l’individualisation des constituants, leur quantification et le calcul de leurs indices de rétention (Ir).

Le principe est basé sur la séparation des différents solutés gazeux par migration différentielle le long de la phase stationnaire. La phase mobile est un gaz (hélium, azote, argon ou hydrogène), appelé gaz vecteur [74].

Figure 38 : Appareillage pour une chromatographie en phase gazeuse [73].

On distingue trois types de CPG qu’on peut différencier grâce au tableau ci-dessous :

3. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de

masse :

Le but de combiner entre la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse

CPG-SM, après séparation chromatographique, est d’ajouter à la chromatographie une deuxième dimension analytique [76]. Le principe consiste à transférer les composés séparés par chromatographie en phase gazeuse par la phase mobile (le gaz vecteur) dans le spectromètre de masse au niveau duquel, ils vont être fragmentés en ions de masse variables dont la séparation sera en fonction de leur masse [37, 77]. L’identification est ensuite réalisée par comparaison des indices de rétention (Ir) et des données spectrales (spectres de masse) des constituants individualisés avec les caractéristiques de produits de référence contenus dans des bibliothèques de spectres [78].

4. Chromatographie liquide à haute performance :

Cette technique est indiquée pour étudier les constituants non volatils des concrètes et des absolues ou pour effectuer des préfractionnements. Elle peut être couplée également à un analyseur de masse [37].

La chromatographie liquide à haute performance utilise une phase stationnaire très fine et une phase mobile liquide circulant sous l’effet d’une haute pression. Après la séparation des différents constituants de l’échantillon, un calculateur assure l’acquisition et le traitement des données [79].

L’utilisation de la HPLC dans le domaine des huiles essentielles a été délaissée en faveur de la CPG aux résultats probants .Cependant l’analyse par HPLC a un certain nombre d’avantages, notamment lors de la recherche de composés thermolabiles c'est-à-dire difficiles à analyser par CPG. La principale limitation de cette technique réside dans la méthodologie d’analyse des terpènoïdes qui nécessitent un facteur de rétention se trouvant dans un intervalle étroit. D’où l’utilisation le plus souvent de colonne à gel de silice, du n-pentane comme phase mobile, d’une température faible (-15°C en général) et d’un système de détection UV à220

nm. Dans ces conditions-là, la majorité des hydrocarbures mono et sesquiterpènoïdes peuvent être séparés et analysés [80].

Figure 39: Montage pour une chromatographie liquide à haute performance [81].

D’autres conditions chromatographiques ont été testées pour l’analyse des HE en agissant sur :

 Nature de la phase stationnaire (théorie de la chromatographie à complexation argentique ;

 Température de la chromatographie ;

 Mise en place d’un gradient acétonitrile-eau dans la colonne.

Mais malgré tout, le pouvoir séparateur de l’HPLC n’est remarquable que pour les sesquiterpènoïdes et les diterpénoïdes, la CPG faisant mieux pour les monoterpènoïdes. Il est à noter quand même que des chercheurs ont réussi une séparation énantiomèrique par HPLC de sesquiterpènes d’une huile essentielle en utilisant une phase stationnaire chiral [80].

5. Spectrométrie de masse:

La spectrométrie de masse (mass spectrometry ou MS) est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse, et de caractériser leur structure chimique.

Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).

Le principe de la SM repose sur l’introduction d’un composé organique ionisé par bombardement électronique à 70 eV dans le spectromètre de masse. L'ion ainsi obtenu, appelé ion moléculaire, permet la détermination de la masse molaire du composé.

Il peut y avoir des ruptures des liaisons chimiques au sein de l'ion moléculaire, formant ainsi des ions fragments caractéristiques puisque cette dissociation éventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mécanismes bien déterminés.

Ces ions fragments sont ensuite séparés en fonction de leur rapport m/z par l'application d'un champ magnétique et/ou électrique, puis collectés par un détecteur.

L'ensemble de ces ions fragments constitue le spectre de masse dont la lecture permet l'identification de la structure moléculaire [82].

En cas des HE, la SM est la technique qui a comme but la détermination des structures moléculaires de composés isolés. Un spectre de masse d’HE montre toujours des ions moléculaires correspondant aux terpenoïdes avec un rapport m/z de 136, 148,152 et 154. Et par des techniques de focalisation sans séparation préalable on observe les ions métastables de composés tels que l’anéthol, le fenchone, le bornéol et le cinéol…Et une variante consiste en l’introduction directe d’une partie de la plante à HE (0.1-0.2mg) qui libère par chauffage les composés volatils détectés classiquement [83].

6. Résonnance Magnétique Nucléaire :

Parmi toutes les techniques spectroscopiques, la RMN est la technique de choix pour la caractérisation des molécules organiques ; elle permet l’accès à des informations concernant le squelette et la fonctionnalisation des molécules [84].

L’originalité de la RMN par rapport aux autres techniques spectroscopiques réside dans le fait d’apporter une information précise et individuelle sur la très grande majorité des atomes constitutifs de la molécule, de permettre l’identification des connexions entre les atomes des diverses entités tout en les situant dans l’espace les uns par rapport aux autres [85].

La RMN repose sur la détection du phénomène de résonnance magnétique qui se produit lorsque des noyaux atomiques de spin non nuls sont placés dans un champ magnétique externe généralement uniforme et qu'ils sont excités par un rayonnement radio-fréquencé accordé sur les différences d'énergie entre les différents états possibles du spin nucléaire.

Concernant les HE, la RMN permet la détermination des structures moléculaires de composés isolés ; mais néanmoins pour l’étude des HE et de mélanges complexes elle présente un certain nombre d’avantages en particulier en présence de composés peu volatils ou instables thermodynamiquement.

Il a été établit depuis les années 80 qu’il est possible de déterminer les constituants d’une huile essentielle en comparant avec des spectres de produits purs [86].

Figure 40 : Similitude entre le spectre résonance magnétique de l’huile essentielle de cèleri et du