Les techniques de couverture

Segundo Samuels (2006), Trichoderma foi proposto pela primeira vez como um gênero por Persoon em 1794, com base em materiais coletados na Alemanha, incluindo quatro espécies na descrição (sem a percepção de que apenas os anamorfos estavam sendo descritos). Somente em 1969 que foi realizada a primeira revisão taxonômica e reclassificada por Rifai. A partir daí, um maior número de espécies foi agregado ao gênero, chegando à

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atualidade com cerca de 83 taxons (espécies, formas e variedades), incluindo Trichoderma e

Hypocrea.

Hypocrea é o gênero que constitui uma das duas fases reprodutivas que Trichoderma

possui, denominada de teleomórfica. Nessa fase o gênero Hypocrea é classificado como ascomiceto da ordem Hypocreales, no qual predomina uma etapa sexual. A segunda fase, denominada anamórfica, prevalece uma etapa assexual (Figura 13), que parece ser independente da fase teleomórfica, seja em nível de indivíduo ou de população (HARMAN et al., 2004). Portanto, as duas formas de uma mesma espécie acabam recebendo nomes diferentes. Caso típico é o que ocorre com T. reesei, considerado como a forma anamórfica do fungo Hypocrea jecorina (teleomorfo), ambos representando a mesma espécie. As espécies do gênero Trichoderma são micro-organismos presentes no solo, em materiais vegetais e substratos em decomposição, e, em geral, são organismos dominantes na microflora de solos de uma grande variedade de “habitats”, atribuindo-se tal fato à sua diversa capacidade metabólica e à sua natureza competitiva (SAMUELS, 1996).

FIGURA 13 – Ciclo de vida assexuada de T. reesei. Fonte: Adaptado de (RIES, 2013a).

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Segundo a classificação taxonômica no banco de dados “National Center for

Biotechnology Information – NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/), Trichoderma reesei tem a seguinte classificação: Taxonomy ID: 51453; Super-reino: Eukaryota; Reino: Fungi; Filo: Ascomycota; Ordem: Hypocreales; Família: Hypocreaceae; Gênero: Hypocrea;

Espécie: Hypocrea jecorina – teleomorfo e Trichoderma reesei – anamorfo.

Morfologicamente, T. reesei apresenta hifas septadas, ramificadas (5-10 μm de diâmetro), polinucleadas, de núcleo haplóide, que formam colônias brancas de rápido crescimento, formando almofadas verdes ou amarelas de filamentos de esporulação. Os filamentos férteis, conidióforos, produzem fileiras laterais de pequenas fiálides. Os mitoesporos (conídios de cor verde e de 3 a 5 μm de diâmetro) são produzidos sucessivamente no extremo da fiálide e agrupados em pequenas massas (SCHUSTER; SCHMOLL, 2010).

Juntamente com Neurospora, Penicillium e Aspergillus, o gênero Trichoderma é um dos mais estudados entre os fungos filamentosos devido ao seu grande potencial de aplicação do ponto de vista industrial e biotecnológico (SAMUELS, 1996). Com destaque para T.

reesei, um fungo filamentoso, mesófilo dotado com um enorme repertório de enzimas

hidrolíticas (celulases e hemicelulases) relacionadas com a desconstrução da biomassa lignocelulósica de plantas que são de grande importância para os processos biotecnológicos, principalmente na indústria de papel ou produção de combustível de segunda geração (TOMME et al., 1988; STERNBERG; MANDELS, 1979; SCHUSTER; SCHMOLL, 2010; MAURYA et al., 2012; MINTY et al., 2013).

Uma particularidade importante de T. reesei é que todas as linhagens utilizadas na produção e pesquisa industrial são derivadas de um único isolado natural QM6a (o tipo

selvagem sequenciado por Martinez et al., (2008), compreendendo 9129 genes com,

aproximadamente, 34 Mbp), que foi originalmente isolado nas Ilhas Salomão durante Segunda Guerra Mundial (VITIKAINEN et al., 2010). Todas as mutações com potencial impacto sobre a produção de celulases foram analisadas com o objetivo de aumentar a produção. Assim, duas séries foram obtidas a partir da linhagem QM6a, Figura 14, (KUBICEK, 2013, p.137):

1) Série Rutgers – na Universidade Rutgers (New Jersey/EUA), foram desenvolvidas as linhagens RUT-M7, RUT-NG14 e RUT-C30. Esta última linhagem, é mais bem caracterizada, sendo referência entre os grandes produtores de celulases é a mais utilizada desta série, e que passou por três mutações (uma truncagem do gene que codifica o repressor catabólico de carbono CRE1 (ILMÉN et al., 1996); uma mutação de “frameshift” no gene gls2 da subunidade alfa envolvido na glicosilação

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de proteína que aumenta a secreção da proteína (GEYSENS et al., 2005); e uma deleção de 85-kb, que eliminou 29 genes, incluindo transportadores, fatores de transcrição e enzimas metabólicas primárias (SEIDL et al., 2008) foram descritas anteriormente para ocorrer na linhagem RUT-C30.

2) Série Natick: Laboratório Natick (Massachusetts/EUA), foram desenvolvidas as linhagens QM9123 e QM9414 por acelerador linear (LA), sendo que foram identificados mais de quarenta mutações de vários tipos, e a linhagem QM9414 produz quatro vezes mais enzimas do que a cepa isolada QM6a (VITIKAINEN et al., 2010; KUBICEK, 2013). Todas as mutações em QM9414 podem ser verificadas no trabalho de Vitikainen e colaboradores (2010).

FIGURA 14 – Genealogia dos mutantes de T. reesei QM6a.

UV: radiação ultravioleta; LA: acelerador linear e NTG: nitrosoguanidina. Os mutantes negativos para produção de celulases estão localizados dentro da caixa azul (QM 9136 e QM 9978).

Fonte: Adaptado de (KUBICEK, 2013; VITIKAINEN et al., 2010).

2.3.2 CAZy

O fungo filamentoso T. reesei produz enzimas capazes de clivar ligações existentes em carboidratos. Estas enzimas são conhecidas como Glicosil Hidrolases (GHs), Glicosil Transferases (GTs), Polissacarídeos Liases (PLs), Carboidratos Esterases (CEs), Módulo de ligação a carboidratos (CBM) e Polissacarídeos monooxigenase (PMOs – e, recentemente, consideradas como uma nova classe de enzima, “Atividades auxiliares (AAs)” – (LOMBARD et al., 2014), que são classificadas e descritas no banco de dados Carbohydrate-Active

enZYmes Database (CAZy - www.CAZy.org) (HÄKKINEN et al., 2012). Esse banco de dados

descreve as famílias de proteínas estruturalmente relacionadas à atividade catalítica ou de ligação a carboidratos que sejam capazes de degradar, modificar ou criar ligações glicosídicas. Utiliza também a sequência de aminoácidos para correlacionar os mecanismos

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de ação e enovelamentos proteicos em famílias distintas. As famílias proteicas do CAZy são normalmente designadas através de um formulário simples, incluindo a classe ou categoria do módulo e um número que reflete a ordem da criação familiar dentro do mesmo grupo (CANTAREL et al., 2009). O genoma de T. reesei codifica caracterizadas enzimas como: 10 celulases e 16 hemicelulases que demonstrou ser importante para aplicações industriais (HÄKKINEN et al., 2014), além de apresentar uma quantidade de genes que codificam CAZy (FOREMAN et al., 2003; MARTINEZ et al., 2008). De acordo com uma anotação de atualização, realizada em 2012, o genoma de T. reesei codifica 201 genes glicosil hidrolases, 22 genes carboidratos esterases e 5 genes polissacarídeos liases, dos quais, pelo menos, 66 são genes conhecidos ou previstos para codificar atividades celulolíticas e hemicelulolíticas (HÄKKINEN et al., 2012).

2.3.3 O processo de hidrólise enzimática: ação sinérgica dos sistemas celulolítico e