L’intervalle entre les déclarations

Neste estudo, verificou-se a influência da ausência do fator de transcrição XYR1 na expressão gênica de T. reesei, em que, a linhagem mutante Δxyr1 foi comparada à parental (QM9414) nas mesmas condições. Assim, dos 9129 genes que compõem o genoma de T.

reesei, 2185 genes foram diferencialmente expressos em celulose, 2124 genes em soforose e

apenas 46 genes em glicose (Figura 55). Gráficos Volcano plot também foram construídos para demonstrar quantos desses genes foram up- ou down-regulados, isto é, utilizou-se o

limiar já aplicado anteriormente (p-valor ≤ 0,05 e Log2 Fold Change ≥ 1 or ≤ -1) nos dados

gerados, identificando os genes up- e down-regulados, resultando no total 1379 genes (Figura 56). Diagramas de Venn dos genes up- e down-regulados em resposta às condições estudadas

(Figura 57), apresentam a maioria dos genes modulados nas duas condições indutoras e

poucos genes foram modulados na condição repressora. No total, foram identificados 749 genes up-regulados, sendo 333 genes específicos da condição celulose, 364 genes da condição soforose e 18 genes da condição glicose. Entre os genes down-regulados, 623 genes foram identificados, sendo 380 genes específicos da condição celulose, 221 genes da condição soforose e 8 genes da condição glicose (Figura 57).

Analisando o perfil transcricional dos 1379 genes, diferencialmente expressos tanto up- como down-regulados, construiu-se um heatmap para verificar a clusterização dos genes e condições (Figura 58). Dessa forma, foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados (294 genes controlados por celulose; 338 genes controlados por soforose e 15 genes controlados por glicose) e outros 3 regulons compostos por genes down-regulados (350 genes controlados por celulose; 181 genes por soforose e 8 genes por glicose), totalizando 1186 genes regulados pelas condições analisadas. Por meio da categorização funcional, baseando-se no Gene Ontology (GO), dos 1186 genes, foi possível destacar que a maioria dos genes tem função desconhecida e reforça a importância de outros componentes na regulação da transcrição de genes de tal maneira que, mesmo com a ausência do principal fator de transcrição envolvido na produção de enzimas de interesse biotecnológico, muitos genes sofreram regulação. A lista de todos os genes dos regulons identificados para a linhagem mutante comparado a linhagem parental pode ser verificada no CD Anexo (Arquivo 12, Tabelas 12.1 a 12.6).

Analisando-se os 1379 genes identificados como diferencialmente expressos entre as linhagens mutante e parental, pergunta-se: como esses genes se inter-relacionam? Existem

Lílian dos Santos Castro 152 Análise global da expressão gênica durante a formação de celulases pelo fungo Trichoderma reesei

genes comuns às três condições? Quantos genes são específicos de cada condição analisada? Portanto, do mesmo modo que foi realizada para a linhagem parental QM9414, construiu-se uma rede regulatória dependente das fontes de carbono, utilizando todos estes genes modulados positivamente ou negativamente (Figura 59). Assim, 643 genes são específicos somente da condição celulose, 517 genes da condição soforose e 23 genes da condição glicose. Os genes que se inter-relacionam são: 170 genes entre as condições celulose e soforose, 14 genes entre as condições soforose e glicose, 7 genes entre as condições celulose e glicose. Apenas 2 genes são regulados de maneira comum nas três condições analisadas (Figura 59 – para mais detalhes ver CD Anexo, Arquivo 13, Tabelas 13.1 a 13.10 para identificação de todos os genes da rede regulatória).

FIGURA 55 – Comparação do perfil de expressão gênica da linhagem mutante Δxyr1 comparado com a linhagem parental QM9414 crescidos em celulose, soforose e glicose como fontes de carbono obtidos por RNA- seq.

(A) Δxyr1/QM9414 Celulose; (B) Δxyr1/QM9414 Soforose e (C) Δxyr1/QM9414 Glicose. Genes diferencialmente expressos obtidos pelo pacote DESeq estão plotados em vermelho.

Lílian dos Santos Castro 153 Análise global da expressão gênica durante a formação de celulases pelo fungo Trichoderma reesei

FIGURA 56 – Gráficos volcano plot dos genes diferencialmente expressos up- e down-regulados nas condições estudadas (Δxyr1/QM9414).

(A) Δxyr1/QM9414 Celulose; (B) Δxyr1/QM9414 Soforose e (C) Δxyr1/QM9414 Glicose. Genes up-regulados (Log2 Fold Change ≥ 1 e p-valor 0,05) estão destacados em pontos vermelhos e genes down-regulados (Log2

Fold Change ≤ -1 e p-valor 0,05) estão em verde.

FIGURA 57 – Diagramas de Venn representando o número de genes diferencialmente expressos na linhagem mutante Δxyr1 comparado com a linhagem parental QM9414.

Lílian dos Santos Castro 154 Análise global da expressão gênica durante a formação de celulases pelo fungo Trichoderma reesei

FIGURA 58 – Perfil de expressão de genes de T. reesei durante crescimento na presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono na linhagem mutante Δxyr1 comparado com a linhagem parental QM9414 e categorização funcional baseado no Gene Ontology.

(A) Clusterização hierárquica dos genes significativos up- e down-regulados em T. reesei. Utilizou-se o software

Mev v.4.6.1, com o método “average linkage” para gerar os clusters e correlação “uncentered”. A distância

Euclidiana foi usada para verificar as diferenças entre os 1379 genes e os grupos (condições) baseado na distância do centro dos grupos, p < 0,05. (B) Genes down-regulados em glicose. (C) Genes down-regulados em soforose. (D) Genes up-regulados em celulose. (E) Genes up-regulados em soforose. (F) Genes down-regulados em celulose. (G) Genes up-regulados em glicose.

Lílian dos Santos Castro 155 Análise global da expressão gênica durante a formação de celulases pelo fungo Trichoderma reesei

FIGURA 59 – Rede regulatória de 1379 genes diferencialmente expressos na linhagem mutante Δxyr1 comparado com a linhagem parental QM9414 em resposta a diferentes fontes de carbono.

Genes são representados como “nodes” (quadrados azuis), e as interações são representadas como linhas, interações vermelhas (up-regulados) e interações verdes (down-regulados), que conectam os nodes com 1574 interações.

Dentre os genes diferencialmente expressos foram destacados os top 15 genes down- regulados na ausência do fator de transcrição XYR1 (Tabela 25). A ausência deste fator afetou a expressão de glicosil hidrolases (GHs) nas duas condições indutoras, sendo 8 GHs em ambas condições. As mais down-reguladas na condição celulose foram: GH12 (ID123232, -11.71); GH61 (ID120961, -10.95); GH10 (ID120229, -9.99). Em soforose: GH7 (ID123989, -8.95) e GH6 (ID72567, -8.91). Porém, na condição repressora, somente a GH16 (ID50215, - 1,48) foi afetada. Duas glicosil hidrolases, GH5 (ID56996, -9.66) e GH11 (ID123818, -8.77) foram exclusivamente as top down-reguladas em celulose. Enquanto que, na condição soforose outras glicosil hidrolases foram exclusivamente identificadas: GH3 (ID121127, - 7.95), GH5 (ID49976, -7.68), GH115 (ID123940, -7.56) e GH7 (ID122081, -6.59).

Lílian dos Santos Castro 156 Análise global da expressão gênica durante a formação de celulases pelo fungo Trichoderma reesei

Em glicose, entre os top genes down-regulados estão uma HFB113 (ID73173, -2.00) e outros

13 genes (não sendo verificado estes genes nas outras duas condições) que estão apresentados na Tabela 23. Com esses dados, nota-se que o regulador XYR1 é essencial na expressão de enzimas importantes para a degradação da biomassa.

Tabela 23 – Top 15 genes down-regulados em celulose, soforose e glicose na ausência do regulador XYR1.

Celulose

Proteína ID Descrição FC GO (Categoria Principal)

123232 GH12 endo-ß-1,4-glucanase -11,71 molecular_function

120961 GH61 polysaccharide monooxygenase CEL61b -10,95 #N/D

120229 GH10 endo-ß-1,4-xylanase XYN3 -9,99 biological_process

56996 GH5 β-Mannanase MAN1 -9,66 biological_process

120312 GH5 endo-β-1,4-glucanase EGL2/CEL5a -9,54 molecular_function

69957 MFS permease -9,1 cellular_component

73638 CIP1 -9,06 molecular_function

72567 GH6 Cellobiohydrolase CEL6A/CBH2 -9,05 molecular_function

123989 GH7 Cellobiohydrolase CBH1/CEL7a -8,84 molecular_function

123818 GH11 endo-ß-1,4-xylanase XYN2 -8,77 biological_process

73643 GH61 polysaccharide monooxygenase CEL61a -8,63 molecular_function

121418 lipase G-D-S-L -8,59 molecular_function

72526 GH67 α-Glucuronidase GLR1 -8,49 molecular_function

73632 CE5 acetyl xylan esterase AXE1 -8,46 molecular_function

Soforose

Proteína ID Descrição FC GO (Categoria Principal)

123989 GH7 Cellobiohydrolase CBH1/CEL7a -8,95 molecular_function

72567 GH6 Cellobiohydrolase CEL6A/CBH2 -8,91 molecular_function

73638 CIP1 -8,49 molecular_function

123232 GH12 endo-ß-1,4-glucanase -8,29 molecular_function

121418 lipase G-D-S-L -8,2 molecular_function

72526 GH67 α-Glucuronidase GLR1 -8,18 molecular_function

121127 GH3 β-xylosidase BXL1 -7,95 biological_process

120312 GH5 endo-β-1,4-glucanase EGL2/CEL5a -7,84 molecular_function

49976 GH5 endo-β-1,4-glucanase EGL5/CEL45a -7,68 molecular_function

120961 GH61 polysaccharide monooxygenase CEL61b -7,65 #N/D

56840 unknown protein -7,6 molecular_function

123940 GH115 methylglurunoyl esterase CIP2 -7,56 molecular_function

122081 GH7 Endo-β-1,4-glucanase EGL1/CEL7b -6,59 molecular_function

120229 GH10 endo-ß-1,4-xylanase XYN3 -6,42 biological_process

73643 GH61 polysaccharide monooxygenase CEL61a -6,29 molecular_function

Glicose

Proteína ID Descrição FC GO (Categoria Principal)

73173 HFB1 -2 biological_process

50212 GT Glycosyltransferases not yet assigned to a family -1,91 #N/D

65522 unknown protein -1,75 biological_process

50215 GH16 endo-1,3-β-D-glucosidase/1,3-glucan binding protein -1,48 biological_process

76784 sorbitol dehydrogenase -1,42 molecular_function

42053 unknown protein -1,33 cellular_component

78738 sodium/hydrogen exchanger family protein -1,31 #N/D

112499 Zn2Cys6 transcriptional regulator -1,3 molecular_function

78864 GcvTGlycine cleavage system T protein -1,24 biological_process

73937 Ornithine carbamoyltransferase OTC/ARG3 -1,23 biological_process

73631 isoamyl alcohol oxidase -1,2 biological_process

80268 fumarate lyase -1,19 molecular_function

75294 BCAT_beta_family -1,17 biological_process

120370 unknown protein -1,11 #N/D

*#N/D = Desconhecido.

13

São um grupo de pequenas proteínas ricas em cisteína (com aproximadamente 100 aminoácidos) que são expressas apenas por fungos filamentosos. Com base em diferenças nos padrões de hidropatia e propriedades biofísicas, dividem-se em duas categorias: classe I e classe II. São geralmente encontradas na superfície exterior dos conídios e da parede das hifas, e podem estar ligadas à mediação de contato e comunicação dos fungos com o seu ambiente (HAKANPÄÄ et al., 2006).

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Após determinação dos perfis transcricionais, foi realizada a categorização funcional dos genes diferencialmente expressos de acordo com o Gene Ontology. As categorias super- representadas em cada uma das condições analisadas, foram determinadas a partir da análise de enriquecimento implementada pelo algoritmo BayGO (VÊNCIO et al., 2006). Na Figura 60, verifica-se a participação de poucos genes na condição glicose, sendo a maioria das funções encontradas exclusivamente nesta condição foram: copper ion trnasmembrane

transporter activity, monooxygenase activity, ferric-chelate reductase activity, copper ion transport, nucleotide binding, ATPase activity coupled to transmembrane movement of substances e nucleoside-triphosphatase activity, todos encontrados de maneira up-regulados.

Apenas catalytic activity foi identificada como down-regulado em glicose. Somente a categoria electron transport foi comum à condição repressora (glicose) e a condição indutora

(soforose).Na condição indutora celulose, a categoria metabolic process foi a mais afetada na

ausência do fator XYR1 seguida por: oxidoreductase activity, membrane, transport, integral

to membrane e electron transport. Outras categorias foram super-representadas tanto em

celulose como em soforose: oxidoreductase activity, carbohydrate metabolic process,

hydrolase activity hydrolyzing O-glycosyl compounds, sugar (hydrogen symporter activity) e carbohydrate transport.

Lílian dos Santos Castro 158 Análise global da expressão gênica durante a formação de celulases pelo fungo Trichoderma reesei

FIGURA 60 – Categorização funcional de acordo com o GO de genes diferencialmente expressos na linhagem mutante (Δxyr1) comparado com a linhagem parental (QM9414).

Análise de enriquecimento de genes up- e down-regulados em Δxyr1/QM9414 em celulose, soforose e glicose como fontes de carbono. Os termos enriquecidos do GO correspondem à função molecular, componente celular e processo biológico em T. reesei. Categorias significativamente enriquecidas são mostradas (p ≤ 0,05).

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