1. Purification sur gel des fragments PCR
Les produits d’amplification sont déposés sur un gel d’agarose 1 % puis purifiés suivant les instructions du kit de purification sur gel ‘QIAquick Gel extraction kit’ (QIAGEN). Brièvement, le fragment d’ADN est excisé du gel d’agarose à l’aide d’un scalpel, placé dans un tube Eppendorf et pesé. Pour chaque 100 mg de gel, 100 µL de tampon QG (fourni avec le kit) sont ajoutés. Le tube est incubé 10 min à 50°C. Après dissolution du gel, le mélange est transféré sur une colonne et centrifugé 1 min à 13000 g. La colonne est lavée avec 750 µL de tampon PE (fourni avec le kit) et centrifugée 2 fois 1 min à 13000 g. Le fragment d’ADN est élué par 50 µL de tampon Tris HCl 10 mM pH 8,5 avec une centrifugation de 1 min à 13000 g.
2. Clonage de fragments dans le vecteur pGEMT-easy
Le clonage de fragments d’ADN dans le vecteur pGEMT-easy est utilisé pour séquencer, multiplier et conserver tous les fragments d’ADN.
La ligation dans le vecteur pGEMT-easy peut se faire une nuit à 4°C ou 2 h à température ambiante. Afin de s’assurer d’une bonne efficacité de la ligation, l’insert est concentré en respectant un rapport insert /vecteur de 3 : 1, en accord avec les instructions du kit (Promega). Le mélange de ligation est composé de 2,5 µL de tampon ligase 2X, 0,5µL de vecteur, 0,5 µL de T4-DNA ligase à 3 U.µL-1 et de 1,5 µL d’insert.
La polymérase hautement fidèle (Pfu HotStart Turbo-polymerase, Stratagène) ne présente pas d’activité de polyadénylation. Pour sous-cloner un fragment amplifié avec ce type de polymérase, il est nécessaire d’ajouter des groupements adénosine aux extrémités du fragment amplifié.
A 7 µL de produit PCR purifié, sont ajoutés 1 µL de Taq-polymérase (Promega), 1 µL de dATP 10 mM et 1 µL de tampon de réaction de l'enzyme Taq-polymérase. L’ensemble est placé 15 à 30 min à 72°C. La même réaction peut être réalisée directement sur les 20 µL de réaction PCR. Dans tous les cas, une purification des produits PCR est nécessaire afin d’éliminer les dATP non incorporés.
L’introduction des plasmides dans la souche DH5α est réalisée grâce à un choc thermique (42°C pendant 60 sec suivi d'un passage dans un bain de glace ; Sambrook et al., 1989).
3. Sous-clonage dans les vecteurs d’expression bactérienne
Les fragments d’ADN à sous-cloner dans des vecteurs d’expression sont amplifiés par PCR avec des amorces dont la séquence contient les sites de restriction nécessaires. Après amplification, ils sont dans un premier temps clonés dans le vecteur pGEMT-easy (Promega) dans les conditions déjà décrites. Après vérification de la séquence, le plasmide est multiplié, purifié et l’insert est isolé par digestion.
Parallèlement, le vecteur d’expression bactérienne est également multiplié et digéré par les enzymes adéquates.
L’insert est ensuite ligué au vecteur grâce à l’action de la T4-DNA ligase (Promega). Les rapports insert/vecteur, ainsi que le mélange de réaction sont les mêmes que ceux utilisés lors de la ligation d’un insert dans le vecteur pGEMT-easy. Les plasmides sont ensuite introduits dans les souches DH5α et M15 par choc thermique.
4. Sous-clonage par recombinaison avec le système GATEWAYTM
L’introduction d’un gène dans un vecteur GatewayTM nécessite l’obtention d’un
vecteur d’entrée pENTR/D-TOPO contenant le gène d’intérêt. La réaction se fait grâce à la topoisomérase I, extraite de Vaccinia virus. Son rôle biologique est de couper et de religuer l'ADN pendant la réplication. Elle reconnaît spécifiquement la séquence pentamérique 5´-(C/T)CCTT-3´ et forme une liaison covalente avec le phosphate de la thymidine en 3'. Elle coupe un des deux brins d'ADN, assurant le déroulement de l'hélice d'ADN, puis associe les
extrémités du brin coupé. Pour exploiter l'activité de ligation de la topoisomérase I, le vecteur pENTR-D/TOPO est linéarisé et la topoisomérase est fixée de façon covalente sur les extrémités 3' des deux brins d'ADN. Elle permet aux vecteurs de se refermer en intégrant une séquence d'ADN avec des extrémités compatibles. Le gène est donc amplifié par PCR avec des amorces permettant d'ajouter des sites attL1 et attL2 de recombinaison au gène d'intérêt, mais aussi du côté 5' quatre bases supplémentaires (CACC) qui vont assurer le clonage directionnel du gène dans le vecteur pENTR-D/TOPO. Le clonage se fait dans les conditions décrites par le protocole fourni avec le vecteur (Invitrogen). Des cellules TOP10 d’E. coli sont ensuite transformées avec ce vecteur par choc thermique suivant le protocole fourni par le fournisseur (Invitrogen), puis sélectionnées sur un milieu Luria Broth (LB, Sigma) contenant
de la kanamycine à 50 mg.L-1. L’ADN plasmidique est extrait par lyse alcaline, puis vérifié
par restriction et séquençage.
Lorsque le vecteur d’entrée est vérifié, l’insert est introduit dans le vecteur GatewayTM grâce à une réaction de recombinaison mettant en jeu la LR-clonase (Invitrogen). La recombinaison se fait entre des sites de recombinaison semblables à ceux des phages λ, et plus précisément entre les sites attL (1 et 2) et attR (1 et 2) du vecteur d'entrée et du vecteur de destination, respectivement. La réaction se fait dans les conditions décrites par le protocole d'utilisation de la LR-clonase (Invitrogen). Des cellules DH5α d’E. coli sont transformées par choc thermique. Les cellules sont sélectionnées sur un milieu LB contenant de la
streptomycine ou de la spectinomycine, indifféremment, à 50 mg.L-1. L’ADN plasmidique est
récupéré par lyse alcaline, puis vérifié par restriction et séquençage.
Le vecteur ainsi obtenu est enfin introduit par choc thermique dans des cellules C58pMP90 d’A. tumefaciens. Pour cela, 200 µL de cellules compétentes sont ajoutés dans 100 µL de milieu LB contenant 5 µg d'ADN plasmidique. L'ensemble est placé pendant 5 min dans l'azote liquide, puis pendant 25 min à 37°C au bain-marie. Dix mL de milieu LB sont ajoutés aux bactéries et l'ensemble est placé toute une nuit à 27 à 28°C sans agitation. La culture bactérienne est ensuite centrifugée pendant 10 min à 6000 g et le culot est repris par 300 µL de milieu LB, puis une fraction aliquote est étalée sur un milieu LB contenant de la rifampicine (50 mg.L-1), de la gentamycine (20 mg.L-1) et de la streptomycine (50 mg.L-1).
5. Vérification des produits de clonage et technique de séquençage
Tous les vecteurs plasmidiques sont multipliés et récupérés par minipréparation ou maxipréparation d’ADN. Ils sont triés par restriction suivant les instructions données pour
effectué par la firme GenomeExpress (Meylan, France). Le tableau 8 reprend l’ensemble des constructions obtenues et utilisées dans notre étude.