Techniques de biologie cellulaire

3.1. Transfection des amibes

Afin d’introduire les vecteurs d’expression plasmidiques dans A. castellanii Neff, une transfection utilisant un vecteur lipidique (Viafect™ transfection reagent, Promega) a été réalisée. Le milieu d’enkystement a été utilisé pendant la première phase de la transfection afin d’éviter de faire précipiter le transfectant.

Un volume par puits de 125 µl d’une suspension cellulaire à 1.106 _cellules/ml

dans du milieu d’enkystement a été déposé dans une plaque 24 puits. Par la suite, 5 µl de transfectant ont été mis en contact avec 1 µg d’ADN plasmidique dans 150 µl de milieu d’enkystement avant d'être incubés 15 minutes à température ambiante. Cette préparation a ensuite été ajoutée directement dans le puits et la plaque a été incubée pendant 3 heures à 30°C sans agitation, puis 750 µl de milieu PYG ont été ajoutés dans le puits. Après une incubation de 24 heures, le contenu du puits a été transféré dans une flasque de culture de 25 cm² contenant du milieu PYG supplémenté de 25 µg/ml de généticine G418 (Sigma). La flasque a été incubée pendant deux semaines à 30°C, puis la concentration en généticine G418 a été augmentée à 50 µg/ml afin de mieux sélectionner la population cellulaire ayant reçu le plasmide.

Une estimation de la viabilité de ces amibes transfectées a été réalisée en utilisant le bleu trypan (BT) et l’iodure de propidium (IP).

Le bleu trypan (BT) est un colorant soluble dans l’eau qui est utilisé pour distinguer une cellule viable, d’une cellule non-viable par test d’exclusion. En effet, c’est un colorant qui rentre dans les cellules, mais lorsque cette dernière est vivante, la molécule va être éjectée dans le milieu extérieur. Dans le cas des cellules mortes, le colorant s’accumule et les colorent en bleu. L’observation se fait par microscopie photonique. Afin de tester la viabilité des amibes transfectées, les cellules ont été décollées 5 jours après l’augmentation de la concentration en G418, et ont ensuite été

diluées dans du bleu trypan à une concentration finale de 0,2 %. Le comptage a été effectué trois fois pour chacune des conditions en utilisant les lames de comptage FastRead 102® (Biosigma).

L’iodure de propidium (IP) est un agent intercalant des acides nucléiques et est également fluorescent. Lorsque la cellule perd son intégrité membranaire, dans le cas d’une mort cellulaire, la molécule pénètre dans la cellule et joue son rôle d’intercalant. Afin de tester la viabilité cellulaire par l’intermédiaire de l’IP, les cellules ont été décollées 5 jours après l’augmentation de la concentration en G418 et ont ensuite été incubées avec de l’IP (1 µl d’IP pour 200µl de suspension cellulaire) et ont été analysées en cytométrie de flux (Cytoflex, Beckman Coulter). Les cellules détectées comme positives au marquage IP ont été considérés comme non-viables. Trois répétitions ont été effectuées indépendamment.

3.2. Estimation de la croissance amibienne

Afin de tester l’effet de la surexpression des protéines sur la croissance des amibes, 1 ml de tampon PAS contenant une quantité de 5.104 _{cellules a été inoculé}

dans une plaque 24 puits. La plaque a ensuite été incubée à 30 °C pendant 1 heure afin que les amibes adhèrent. Par la suite, le tampon PAS a été remplacé par du milieu PYG, ce qui correspond au temps 0, et la plaque a été incubée à 30 °C. Les cellules ont été décollées après 2, 24, 48 et 72 heures et comptées par l’intermédiaire d’une lame de comptage FastRead 102® (Biosigma).

3.3. _{Dosage de la production d’ATP}

Afin de tester l’effet de la surexpression sur la production d’ATP, une analyse par l’intermédiaire du kit CellTiter-Glo® (Promega) a été réalisée. Le mélange fourni par le kit induit une lyse des cellules et génère un signal luminescent qui sera proportionnel à la quantité d’ATP présent (Figure 11). Une quantité de 5.104 _amibes

dans 100 µl de milieu PYG a été inoculée dans des puits d’une plaque 96 puits. La plaque a ensuite été incubée à température ambiante pendant 30 minutes. Un volume de 100 µl de produit de réaction (CellTiter-Glo®, Promega) a été ajouté à chacun des puits, puis la plaque a été incubée pendant 2 min sur un agitateur de plaque afin de lyser les cellules. La plaque a ensuite été incubée pendant 10 minutes à température ambiante et à l’obscurité. La quantification du signal lumineux a été effectuée par l’intermédiaire du lecteur de microplaques multimode TriStar² (Berthold). L’expérience

a été répétée trois fois de façon indépendante, et trois réplicats par expérience ont été analysés.

Figure 11 _{: Réaction chimique médiée par la Luciférase (d’après la fiche produit du kit} CellTiter-Glo®, Promega). En présence d’adénosine triphosphate (ATP), de Mg2+_{, et d’O}

2,

l’Ultra-Glo™ RLuciferase va induire une mono-oxygénation de la luciférine en oxyluciférine ce qui génère un signal lumineux.

3.4. Quantification du lucifer yellow internalisé

L’effet de la surexpression sur le processus d’endocytose a été testé par cytométrie en flux en utilisant le lucifer yellow (LY), une molécule fluorescente. Cette molécule ne traverse pas la membrane plasmique par diffusion, son internalisation s’effectue donc par endocytose. Pour cela, un volume de 1 ml de milieu PYG contenant 105 _{cellules a été inoculé dans une plaque 24 puits. La plaque a ensuite été incubée à}

30 °C pendant 24 h heures. La molécule LY a ensuite été ajoutée à une concentration de 0,025 % final dans du PYG dans chacun des puits. La plaque a été incubée durant 15 min à l’obscurité et à 30 °C. Les amibes ont finalement été lavées deux fois dans du tampon PAS, puis décollées par aspiration-refoulement dans 1 ml de tampon PAS.

La quantification du LY internalisé dans les amibes a été effectuée par cytométrie de flux (Cytoflex, Beckman Coulter) en déterminant l’intensité médiane de fluorescence de la molécule détectée dans la population totale amibienne. Trois répétitions ont été réalisées pour cette expérience. Des amibes contrôles non- transfectées qui n’ont pas été incubées avec la LY ont été utilisées afin de calibrer la détection du signal fluorescent du cytomètre de flux.

3.5. Enkystement des amibes

Dans le but de tester l’effet de la surexpression des gènes sur le processus d’enkystement, un suivi du pourcentage de kystes par microscopie à fluorescence a été réalisé. Pour cela, les A. castellanii transfectées ou non transfectées ont été inoculées dans une plaques 24 puits, à une densité de 5.104 _{amibes/puits dans du}

tampon PAS. La plaque a ensuite été incubée durant 1 h à 30 °C sans agitation afin de faire adhérer les cellules. Le tampon a été enlevé, puis du milieu d’enkystement a été ajouté, ce moment correspondant aux temps 0 h de l’enkystement. La plaque a ensuite été incubée à 30 °C. Après 24, 48 et 72 heures, du calcofluor white, une molécule fluorescente qui se lie à des glycopolymères, a été ajouté dans le puits en suivant les recommandations du fournisseur. Les cellules ont ensuite été observées en microscopie à fluorescence (Olympus IX51). Les cellules marquées par le calcofluor white sont considérées comme des cellules enkystées, tandis que les autres correspondent à des trophozoïtes. Afin d’estimer le % de cellules enkystées, un ratio des kystes sur les cellules totales a été calculé. Plus de 800 cellules par condition ont été comptées. Cette expérience a été répétée trois fois de façon indépendante.

Afin de suivre l’évolution de l’expression des gènes d’A. castellanii durant le processus d’enkystement, une extraction d’ARN à différents temps après induction de l’enkystement (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) a été réalisée. A partir d’une flasque d’amibes à une confluence d’environ 80%, une quantité de 105 _{amibes a été inoculée dans 2 ml}

de tampon PAS dans des puits d’une plaque 6 puits. Les plaques ont été incubées pendant 1 h 30 à 30 °C (phase d’adhérence). Le tampon PAS a ensuite été remplacé par 4 ml de milieu d’enkystement, ce qui correspond au temps 0 h de la cinétique. Aux temps étudiés, une extraction d’ARN, un traitement DNase et une RT ont été réalisés. Le suivi de l’expression des gènes a été réalisé par qPCR.