a. Techniques d’études utilisées dans les travaux de relations entre bioturbation et communautés procaryotes

De nombreuses techniques permettent de caractériser les communautés bactériennes et archéennes, techniques qui ont beaucoup évolué notamment concernant la structure et la diversité des communautés grâce aux techniques de biologie moléculaire (Forney et al., 2004). Dans cette partie il s’agit de décrire les différentes techniques d’études des communautés qui ont permis de mettre en évidence le contrôle des communautés bactériennes et archéennes par la bioturbation (Tableau II.4).

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Tableau II.4 : Techniques de caractérisation des abondances, biomasse et diversité bactérienne et archéenne utilisées dans les études d’effets de la bioturbation sur les communautés procaryotes.

Paramètre mesuré Techniques Références

Abondances totales  Comptage direct : microscopie à épifluorescence + acridine orange

ou DAPI ^{1 à 16}

Abondances viables

 Acides gras 12

 Approche culturale 5-7

 Nombre le plus probable (NPP) 7 ; 17

 Microscopie à épifluoresence avec sondes marquées spécifiques 9 ; 13 ; 18

Abondances de gènes  qPCR sur ARN16S bactérien et archéen 19-21

Biomasse totale

 Acides gras phospholipidiques 8 ; 17 ; 22-24

 Estimation par mesure microscopique de la longueur et de la

largeur des cellules ⁶

Biomasse viable  Acides gras phospholipidiques 22-23

Production  Taux d’incorporation de thymidine marquée 2 ; 5

Activité

 Hétérotrophe : incorporation et minéralisation de glucose et

d’acétate ⁵

 Sulfato-réduction : injection de sulfate marqué 17 ; 25

 Enzymatique extracellulaire : avec utilisation de diacétate de

fluorescéine ⁸

 Suivant métabolisme : plaques BIOLOG 9

 Système de transport d’électrons (ETSA) : réduction INT en

INT-Formazan ¹¹

 Fixation d’azote : réduction d’acétylène 25-27

 Dénitrification : inhibition par l’acétylène 27

 Oxydation ammoniaque : accumulation des nitrites 20

 Consommation d’oxygène : titration par la méthode de Winkler 13

Composition et diversité

 Acides gras phospholipidiques 8 ; 22-24

 DGGE ^{12 ; 14-15 ;}

19

 Clonage & Séquençage 12 ; 28 ; 29

 RISA et ARISA 16 ; 30-31

 T-RFLP 25 ; 28

1 : Aller & Yingst, 1985 ; 2 : Alongi, 1985 ; 3 : Aller & Aller, 1986 ; 4 : Branch & Pringle, 1987 ; 5 : Reichardt, 1988 ; 6 : Grossman & Reichardt, 1991 ; 7 : Goñi-Urriza et al., 1999; 8: Bird et al., 2000; 9: Wilde & Plante, 2002; 10: Andressen & Kristensen, 2002; 11: Kinoshita et al., 2003 ; 12 : Matsui et al., 2004 ; 13 : Mermillod-Blondin et al., 2005 ; 14 : Papaspyrou et al. ? 2005 ; 15 : Papaspyrou et al., 2006 ; 16 : Bertics & Ziebis, 2009 ; 17 : Hansen et al., 1996 ; 18 : Michaud et al., 2009 ; 19 : Gilbertson et al., 2012 ; 20 : Laverock et al., 2013 ; 21 : Laverock et al., 2014 ; 22 : Dobbs & Guckert, 1988a ; 23 : Dobbs & Guckert, 1988b ; 24 : Steward et al., 1996 ; 25 : Bertics & Ziebis, 2010 ; 26 : Bertics et al., 2010 ; 27 : Bertics et al., 2012 ; 28 : Laverock et al., 2010 ; 29 : Pischedda et al., 2011 ; 30 : Grossi et al., 2006 ; 31 : Cuny et al., 2007.

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Certaines techniques utilisées en écologie microbienne et également dans le cadre d’étude des effets de la bioturbation sur la diversité bactérienne sont basées sur une approche culturale. Cependant, moins de 1% des procaryotes présents dans l’environnement sont cultivables (Hugenholtz, 2002).

D’autres techniques, dont celles utilisées dans le cadre de cette thèse, adoptent une approche moléculaire. Dans l’objectif d’obtenir la diversité de l’ensemble de la communauté, l’ADN ribosomique est ciblé car il s’agit de gènes conservés chez tous les êtres vivants, présentant des polymorphismes de taille et/ou de séquence entre les différentes espèces, ce qui permet de les discriminer. Des gènes spécifiques peuvent aussi être ciblés, permettant alors d’obtenir la diversité au sein d’un groupe fonctionnel spécifique. Par exemple, dans le cas de Laverock et al. (2013), les bactéries et les archées impliquées dans le cycle de l’azote ont été ciblées via les gènes amoA (bactéries et archées oxydant l’ammoniaque), nirS (bactéries dénitrifiantes). Diverses méthodes utilisent cette approche moléculaire :

(1) Méthodes d’empreinte moléculaire ou « fingerprinting ». Ces techniques permettent d’obtenir la diversité de l’ensemble des communautés présentes dans les échantillons traités, et sont surtout utilisées pour comparer la structure des communautés, c’est-à-dire pour obtenir la diversité β.

a. l’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE). Cette technique se base sur le polymorphisme de séquence d’ADN (ou d’ARN), et de leurs différentes propriétés de dénaturation même si ces séquences sont très proches. La diversité est ensuite révélée par migration sur gel.

b. l’analyse de l’espace intergénique ribosomal (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, RISA ; et Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, ARISA). Il s’agit d’une technique de fingerprinting, c’est-à-dire qui donne une empreinte moléculaire des communautés étudiées. Elle permet donc de caractériser la diversité β. Pour cela, elle se base sur le polymorphisme de taille de la séquence intergénique ADNr 16S-23S appelée ITS. Dans le cas de l’ARISA, la phase d’électrophorèse ne se fait pas sur un gel classique d’agarose ou d’acrylamide mais à l’aide d’un séquenceur sur un gel en capillaire. La séquence est alors marquée avec un fluorochrome via l’utilisation d’amorces marquées lors de l’amplification par PCR.

c. l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (Terminal-Restriction Length Polymorphism, T-RFLP). Il s’agit également d’une méthode dite de fingerprinting qui permet d’obtenir la diversité β. Dans ce cas, c’est le polymorphisme de séquence de l’ADNr 16S qui est utilisé. Le fragment de même taille mais de séquences différentes est découpé au niveau d’une séquence

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ciblée en fonction de l’enzyme de restriction utlilisée, située à différents niveaux sur le fragment. Des fragments de tailles différentes sont donc obtenus après cette étape de restriction et peuvent être discriminés par électrophorèse classique ou capillaire.

(2) Clonage et séquençage. Le gène d’intérêt (insert) est amplifié puis inséré dans un plasmide, lui-même cloné dans le génome d’une bactérie, en général Escherichia coli, qui est ensuite mise en culture pour produire un grand nombre de copies de l’insert. Les clones sont ensuite séquencés (Sanger et al., 1977). Après analyses de bioinformatique de comparaison des séquences obtenues à des bases de données, les organismes peuvent être identifiés parfois jusqu’à l’espèce, et être situés sur un arbre phylogénétique.

(3) Approches de métagénomique. La métagénomique permet de caractériser la diversité de communautés entières, et ce grâce à l’utilisation de techniques de séquençage dites à haut débit couplées à de la bioinformatique (Hugenholtz & Tyson, 2008). Elles utilisent des techniques de séquençage de plus en plus perfectionnées, permettant d’obtenir avec une très haute résolution des séquences redondantes que l’on rassemble par bioinformatique pour obtenir des génomes ou bien des séquences d’un gène cible, par exemple l’ARN 16S. Le pyroséquençage est un exemple de technique de séquençage massif, qui peut générer plus de 20 millions de paires de bases en 4 h (Margulies et al., 2005 ; Amend et al., 2010).