f. Abondances procaryotes

 Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est basée sur la fluorescence des cellules marquées au SYBR® Green, après excitation à 488 nm. Le SYBR ® Green s’intercale entre les bases nucléotidiques, ce qui les rend fluorescentes. La distinction des cellules procaryotes se fait grâce à leur propriété de diffusion du faisceau lumineux à angle droit due à leur taille, mais aussi grâce à leur fluorescence verte (FL1) mesurée à 530 ± 30 nm.

La première étape correspond à la désorption des cellules procaryotes du sédiment, selon le protocole modifié de Duhamel & Jacquet (2006). Pour cela, l’échantillon de sédiment a été mélangé à du Tween 80 (concentration finale de 0,5%) et à du pyrophosphate de sodium (concentration finale de 0,1%). Ce mélange a été agité délicatement 30 min à 720 rpm puis passé 20 min dans un bain à ultra-sons. La fraction contenant les cellules procaryotes a ensuite été purifiée par migration sur gradient de densité Gentodenz (1,310 g.mL^-1) (Amalfatino & Fazi, 2008). Une fois récupérée, la fraction

Purification

amplifiats

digérés

Elution sur

colonne

Solution

pure de

fragments

d’ADN 16S

archéen

dosée

Purification ADN archéen

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contenant les cellules a été stockée dans une solution à 3,7% de formaldéhyde, puis stockée à -80°C jusqu’aux analyses. Avant passage dans le cytomètre en flux, les fractions ont été diluées (1 : 100 v : v) dans de l’eau de mer artificielle filtrée sur 0,22 µm, puis colorées pendant 10 min avec du SYBR® Green I pour une concentration de 50µL.mL^-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France). Un standard interne constitué d’une suspension de billes fluorescentes de 0,97 µm de diamètre a été passé avant chaque échantillon à faible flux, 10 µL.min^-1, pour avoir un nombre d’événements inférieur à 500 par seconde (Amalfitano & Fazi, 2008).

Le logiciel CellQuest (Becton, Dickinson and company, Franklin lakes, NJ USA) a été utilisé pour l’acquisition des données. Il fournit un nombre d’événements par minute, c’est-à-dire un nombre de cellules procaryotes par minute. Ce comptage a ensuite été normalisé par rapport au flux du cytomètre, puis ramené au volume de sédiment considéré initialement.

Cette technique de numération a été utilisée pour déterminer les abondances de cellules procaryotes dans les sédiments de la vasière Ouest-Gironde. Elles ont été effectuées à la Plateforme

Cytométrie-Imagerie (Observatoire Océanologique de Banyuls-sur-Mer) par Guillaume Meisterhans

dans le cadre de sa thèse (Meisterhans, 2012).

 PCR quantitative en temps réels (qPCR)

La qPCR permet la quantification du nombre de copies d’ADN en même temps que le fragment est amplifié, grâce à l’utilisation d’un fluorochrome tel que le SYBR Green qui ne s’intercale et ne fluoresce seulement qu’entre une séquence double brin. La fluorescence est mesurée à chaque cycle et est fonction de la quantité de copies produites. Lorsque le cycle seuil (Ct) est obtenu, c’est-à-dire lorsque la fluorescence est plus élevée que le bruit de fond pendant la phase exponentielle de l’amplification, la concentration d’ADN est dès lors en relation avec le nombre de cycles. Grâce à une courbe standard d’étalonnage réalisée en triplicats pour chaque plaque d’échantillon passée, la quantification est alors possible.

La première étape a consisté à préparer ce standard. Pour cela, un fragment d’ADN a été inséré dans un vecteur, le plasmide pGEM®-T (Promega, Charbonnières, France). Une fois la ligation de l’insert dans le plasmide effectuée (incubation une heure à température ambiante puis 12 h à 4°C), a suivi l’étape de transformation bactérienne. Le mélange de ligation a été mis en présence de bactéries, des Escherichia coli thermo-compétentes JM 109 (Promega, Charbonnières, France) : 1 µL du mélange de ligation a été mélangé à 50 µL de bactéries. Le tout a été mis à incuber 20 min dans la glace, puis 45 sec à 42°C pour faire un choc thermique, ce qui fluidifie les membranes des bactéries et permet l’insertion des plasmides. Ensuite, pour solidifier les membranes, le mélange a été incubé 2 min dans la glace. Enfin, du milieu de culture liquide a été ajouté et l’ensemble a été placé 1 h à 37°C, puis étalé sur milieu solide. La culture a été placée à 37°C pendant 12 h. Une dizaine de colonies ont ensuite été récupérées et remises en culture, cette fois dans un milieu liquide, toujours à 37°C. Une amplification par PCR a été réalisée à partir de 5 µL de culture, puis une migration

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électrophorétique sur gel d’agarose a été effectuée pour vérifier que le fragment a bien été intégré. Cette étape de vérification validée, le plasmide a été extrait et purifié par lyse alcaline (Maniatis et al., 1982). Cet ADN extrait et purifié en suspension dans de l’eau ultra-pure avec de la RNase a été dosé, la concentration a été transformée en nombre de copies par unité de volume, puis une gamme de dilution a été préparée : de 1×10³ copies.µL^-1 à 1×10⁸ copies.µL^-1. Cette gamme a été utilisée pour réaliser des courbes standard à chaque passage d’échantillon.

L’abondance d’ADNr 16S bactérien des différentes zones de bioturbation et du tube de M.

palmata a été déterminée par PCR quantitative en temps-réel (qPCR), selon López-Gutiérrez et al.

(2004). La démarche expérimentale est la même que pour une PCR classique, sauf que la présence du colorant permet la visualisation en temps réel de l’amplification et la quantification du nombre de copies. Pour cela, des amorces bactériennes universelles ont été utilisées, ciblant le gène codant pour l’ARNr 16S : 341f (5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’) et 515r (5’-ATT CCG CGG CTG GCA-3’). Le GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Charbinnières, France) a été utilisé. Le milieu réactionnel final (22 µL) était constitué de 1X de la solution GoTaq® qPCR Master Mix contenant les dNTPs, la Taq polymérase et un colorant dsDNA-binding dans du tampon. Mais aussi d’eau ultra-pure et des amorces à 3 µM. Une quantité de 5 ng de matrice d’ADN a été ajoutée à ce milieu réactionnel. L’amplification a été réalisée avec le Mx3000P QPCR System (Stratagene, Agilent Technologies, France). Après une phase de dénaturation initiale de 10 min à 95°C, 45 cycles de dénaturation (95°C, 30 sec), d’hybridation (50°C, 30 sec) et d’élongation (72°C, 30 sec) ont été effectués, suivis par 1 min à 95°C, 30 sec à 65°C, et 30 sec à 95°C. Cette quantification a été réalisée dans le cadre de la plateforme de biologie moléculaire de la Station Marine d’Arcachon (responsables. P. Gonzalez et C. Daffe).

 Bilan des deux méthodes

Ces deux techniques permettent d’approcher différemment l’abondance microbienne. La cytométrie en flux à l’avantage d’être rapide et automatisée en milieu liquide. Elle permet d’obtenir un nombre de cellules procaryotes par échantillon (Lemarchand et al., 2001). Dans le cas du sédiment, elle s’avère moins rapide car nécessite une étape de désorption des biofilms bactériens associés aux particules (Danovaro et al., 2001b). De plus, la distinction entre les abondances bactérienne et archéenne ne peut être obtenue. La PCR quantitative en temps réel est une approche moléculaire moins rapide et automatisée que la cytométrie en flux. Elle nécessite en effet l’extraction et la purification préalable de l’ADN. En revanche, même si dans notre étude nous avons ciblé le groupe des bactéries dans leur ensemble, cette technique rend possible la détermination de l’abondance d’un groupe taxonomique ou fonctionnel précis, grâce à l’utilisation d’amorces ciblées. La qPCR permet d’obtenir un nombre de gènes qui ne peut être extrapolé à un nombre d’individus comme pour la cytométrie. En effet, certains fragments d’ADN peuvent avoir plus ou moins d’affinité vis-à-vis des amorces sélectionnées, leur nombre de copies peut alors être sur- ou sous-estimé (Reysenbach et al.,

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1992 ; Acinas et al., 2005 ; Smith & Osborn, 2009), et un individu peut posséder plusieurs copies de l’opéron ciblé et donc son abondance est surestimée (Klappenbach et al., 2000).

Ces deux approches, bien qu’étant utilisées ici dans le même objectif d’obtenir l’abondance bactérienne et procaryote, n’aboutissent pas au même type de résultats. Ces derniers ne sont donc pas comparables. Ceci ne cause pas de problème dans notre travail car chacune de ces deux techniques a été employée dans deux parties distinctes de la thèse où les abondances ne nécessitent pas d’être comparées entre elles.