Technique d’électrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE

Toutes les techniques d’électrophorèse sont basées sur le principe de la mobilité séquentielle des molécules protéiques dans un support soumis à un courant électrique. Cette mobilité est en fonction de :

1- la charge électrostatique fournie par les acides aminés acides ou basiques. 2- la dimension et la forme des protéines

3- l’intensité du champ électrique (tension aux électrodes et conductibilité de support). 4- la taille des mailles du support.

5- la température de l’électrolyte.

La technique d’électrophorèse utilisée est celle proposée par Laemli, (1970) modifiée par Payne et al., (1979) et Singh et al., (1991).La séparation se fait sur gel vertical en système discontinu, en présence d’un détergent ionisa, le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Le DDT

Nombre d’épis/m²xNombre des grains /épi x PMG Rendement qtx/ha =

43

dénature les protéines en rampant les ponts disulfures, et le SDS détruisant les liaisons faibles. Ceci aboutit à la formation d’un complexe SDS-protéines dénaturé avec une charge négative qui masque la charge nette intrinsèque des protéines et annule ainsi la différence de migration due à la charge électrique. Il permet donc une séparation selon la taille, la conformation et la masse moléculaire. La vitesse de migration des protéines dépend surtout de la taille des mailles du gel et de la température de l’électrolyte.

2.3. 3.1.1. Méthode d’extraction des protéines de réserve

Les protéines de réserve sont extraites à partir de la farine d’un grain entier , selon la méthode de Singh et al .,(1991), adaptée de la méthode de Marchyllo et al.,(1989).Cette méthode se base sur l’extraction séquentielle et nécessite l’utilisation de trois solutions de base (annexe5): Solution (A) 50% v/v propan-l-o1 ; solution (B) 50% v/v propanol-l-ol.0.08M Tris Hcl pH8.8 et solution(C) la solution tampon 2% p/v SDS, 40% p/v 2 glycérol , 0.02 % p/v bleu de bromophénol 0.08 de Tris Hcl pH =8.

Les gliadines sont extraites en premier dans 1 ml de la solution A , pendant 30 minutes à 60°C, avec deux agitations intermédiaires toutes les dix minutes , suivi d’une centrifugation pendant 1 minute. Le surnagent est ensuite récupéré dans un autre eppendorf et mis à l’évaporation toute une nuit à 65°C, on obtient ainsi la fraction gliadine.D’un autre côté le résidu est lavé dans 0.5 ml de la solution A, à 65°C pendant 30 minutes, cette fois sans vortex intermédiaire, puis centrifugé à 10000 tr/min pendant 1 minute, le surnagent est éliminé par aspiration. Et pour s’assurer de l’élimination complète des gliadines, et afin d’éviter toute contamination des préparations ultérieures des gluténines , on réintroduit au résidu , pour la troisième fois 0.5 ml de la solution A , on vortex , on centrifuge à 10000 tr/min pendant 5 minutes , et le surnagent contenant le reste des gliadines est éliminé par aspiration. Le résidu forme le matériel de départ de la procédure d’extraction des gluténines.

Les gluténines sont extraites, en rajoutant au résidu 0.1 ml de la solution B et d’un agent réducteur, le dithiothreil (DTT) à 1% . Après incubation et centrifugation, on rajoute encore de la solution A et un agent alkylant , le 4-vinylpyridine. Le mélange est incubé puis centrifugé. Un aliquote (0.1ml) de surnagent est transféré dans un autre Eppendorf contenant de la solution C, le mélange est bien agité et ensuite incubé pour une compilation du SDS avec le polypeptide des gluténines réduites et alkyles, et après une centrifugation les échantillons sont prêts pour la révélation.

44

Les étapes de l’électrophorèse se font comme suites : -Préparation des gels

Le support de l’électrophorèse est formé d’un gel de séparation (separating gel ) , et d’un gel de concentration (stacking gel) .Ces deux gels sont préparés à base d’acrylamide à 35% (p/v) , de N,N’-méthylène bis-acrylamide à 2% (p/v), du SDS à 10 % (p/v) et de tris-HCL 1M , tamponné à pH 8.8 pour le gel de séparation,et à pH6.8 pour le gel de concentration .Ces deux gels sont polymérisés en présence du Temed et de l’APS .Le gel de séparation est préparé le premier , bien mélangé puis collé entre deux plaques en verre , en laissant un vide de 4 cm pour le stacking gel .une fine couche du butanol est ajouté pour niveler le gel et pour le protéger de l’air .La polymérisation s’effectue à une température ambiante pendant environ 45 minutes .Ensuite , le gel de concentration est préparé , bien mélangé puis coulé , et des peignes à 15 puits sont rapidement insérés après la polymérisation du stacking gel qui s’effectue dans plus de 60 minutes , les peignes sont enlevés en obtenant ainsi des puits servant pour le dépôt des extraits à raison de 15µl chacun.

-Condition de migration

La cuve d’électrophorèse est remplie à raison avec un volume suffisant de tampon de migration, et maintenue à une température constante à 10°C grâce à un système de refroidissement. Le gel qui est d’une dimension de 180 x 105 x 1.5mm est soumis à une intensité constante de 80 mA, et une tension maximale de 1200v .Les protéines chargées négativement migrent vers l’anode et sont séparées selon leur encombrement moléculaire, la migration est arrêtée généralement une demi heure après la sortie du front coloré.

- Coloration et décoloration.

Les gels des protéines sont fixées dans une solution de TCA à 60% , au bleu de coomassie R250 à 1% (p/v) , pendant 24heures sous agitation .Les gels sont ensuite décolorés en les plaçant dans l’eau du robinet pendant toute la nuit .Une fois les gels sont décolorés , ils sont placés dans une solution du glycérol à 10% pendant 1heure d’agitation au minimum pour être séchés et conservés entre deux feuilles de papier polyéthylène.

45

2.3. 4. Etude moléculaire

Elle consiste en l’étude de la diversité génétique des gènes codants des protéines de réserve ; des gluténines HPM , FPM et des gliadines des 100 génotypes des quatre variétés utilisées dans cette recherche par l’utilisation des marqueurs moléculaire PCR-RFLP et le séquençage des gènes codants des protéines de réserve (gliadines et gluténines).

Cette partie a été réalisée en Egypte dans un laboratoire de biotechnologie (Alex biotechnology).