TaqMan Arrays

1.2.1 Présentation

Pour s’assurer qu’une faible dégénérescence nigrostriatale n’était pas un facteur supplémentaire à l’origine de la faible sensibilité des oligoarrays, nous avons à nouveau intoxiqué 40 souris au MPTP en augmentant la dose cumulative de toxine (de 80 à 94 mg/kg). Nous nous sommes cette fois-ci placés à 2 jours et 7 jours après intoxication au MPTP correspondant aux 2 pics majeurs d’infiltration des lymphocytes CD4+ (Kurkowska- Jastrzebska et coll., 1999b ; Brochard et coll., 2009). Comme précédemment, nous avons au préalable vérifié la diminution d’expression de la TH dans le groupe de souris intoxiquées par le MPTP. Par ailleurs, afin de proposer un critère supplémentaire du niveau de lésion nigrostriée, nous avons étudié l’expression de plusieurs gènes sensés refléter l’état d’activation des cellules microgliales ͗ϭϭď͕&ϰͬϴϬ͕yϯZϭ͕ϲϴ͕ɴϮŵ͘

1.2.2 Résumé des principaux résultats

La diminution d’expression de la TH observée dans les groupes de souris intoxiquées par le MPTP était sensiblement plus importante que pour les souris utilisées dans l’approche

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oligoarrays (45% de perte à 2 jours et 7 jours contre 32% à 2 jours et 25% à 5 jours dans l’expérience précédente ; Figure 26).

De façon similaire à CD11b, l’expression des marqueurs microgliaux était modérément augmentée après intoxication par le MPTP. Le marqueur présentant l’augmentation la plus importante était CD68. Pour les expériences de TaqMan Arrays nous avons alors sélectionné les souris sur les critères de neuroinflammation, c'est-à-dire les animaux présentant l’expression de CD68 la plus élevée à 2 jours (en moyenne 245% contre 192% d’expression avant sélection) et 7 jours (186% contre 136% d’expression avant sélection) post-MPTP (Figures 26 et 27).

Figure 26 : Expression de la TH et de CD68 dans le mésencéphale ventral de souris injectées avec une solution saline ou du MPTP. L’expression de la TH est significativement diminuée à 2 jours et 7 jours après intoxication par le MPTP. L’expression de CD68 est significativement augmentée à 2 jours après intoxication par le MPTP (ANOVA sur les rangs, *, P<0,05 vs contrôles).

Figure 27 : Expression de la TH et de CD68 dans le mésencéphale ventral de souris injectées avec une solution saline ou du MPTP après sélection pour les qPCR Arrays. L’expression de la TH est significativement diminuée à 2 jours et 7 jours après intoxication par le MPTP. L’expression de CD68 est significativement augmentée à 2 jours après intoxication par le MPTP (ANOVA à 2 facteurs, §, P<0,05 vs contrôles ; ANOVA sur les rangs, *, P<0,05 vs contrôles).

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Nos données de qPCR obtenues à partir des cartes microfluidiques confirment la diminution de TH chez les animaux intoxiqués au MPTP (Figure 28). De plus nous observons également une augmentation importante d’expression de marqueurs proinflammatoires tels que l’/&Eɶ͕ ůĞ dE&ɲ Ğƚ ů͛IL1-ɴ. Enfin, nous observons une augmentation d’expression de la GFAP dès deux jours après intoxication suggérant le développement d’une gliose réactive associée à la dégénérescence dopaminergique (Figure 28).

Figure 28 : Expression des marqueurs cellulaires dans le mésencéphale ventral de souris injectées avec une solution saline ou du MPTP. L’expression de la TH est significativement diminuée 2 et 7 jours après intoxication par le MPTP. >͛ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶĚĞůĂ'&WĞƚĚƵdEĨɲĞƐƚƐŝŐŶŝĨŝĐĂƚŝǀĞŵĞŶƚĂƵŐŵĞŶƚĠĞϮũŽƵƌƐĂƉƌğƐŝŶƚŽdžŝĐĂƚŝŽŶƉĂƌůĞDWdW͘>͛ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ĚĞ ů͛/&Eɶ ĞƐƚ ƐŝŐŶŝĨŝĐĂƚŝǀĞŵĞŶƚ ĂƵŐŵĞŶƚĠĞ Ϯ Ğƚ ϳ ũŽƵƌƐ ĂƉƌğƐ ŝŶƚŽdžŝĐĂƚŝŽŶ ƉĂƌ ůĞ DWdW͘ >͛ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ĚĞ ů͛/>ϭɴ ĞƐƚ significativement augmentée 7 jours après l’intoxication par le MPTP (ANOVA à 2 facteurs, §, P<0,05 vs contrôles ; ANOVA sur les rangs, *, P<0,05 vs contrôles).

S’agissant des chimiokines, nos résultats montrent une augmentation d’expression de CCL2, CCL3, CCL4, CCL12 et CXCL10 chez les animaux intoxiqués par le MPTP. Ces augmentations étaient considérables 2 jours post-MPTP (supérieures à 10 fois) pour CXCL10, CCL3 et CCL4 (Figure 29 A). Sept jours après intoxication, l’augmentation d’expression de ces facteurs chimiokiniques dans le mésencéphale ventral était plus modeste (entre 2 et 4 fois)

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et pas statistiquement significative. L’expression des chimiokines CCL5, CCL6 et CCL9, quant à elle, augmente à 2 jours et reste augmentée de manière équivalente 7 jours post-MPTP (Figure 29 B).

Figure 29 : Expression des chimiokines dans le mésencéphale ventral de souris injectées avec une solution saline ou du MPTP. A : L’expression de CCL2, CCL3, CCL4, CCL12 et CXCL10 est significativement augmentée 2 jours après intoxication par le MPTP et diminue à des niveaux quasi similaires à ceux des contrôles à 7 jours. B : L’expression des chimiokines CCL5, CCL6 et CCL9 est augmentée 2 post-MPTP et reste augmentée de manière équivalente à 7 jours post-MPTP. (ANOVA sur les rangs, *, P<0,05 vs contrôles).

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S’agissant des molécules d’adhésion et des molécules de la matrice extracellulaire, leur expression n’était que faiblement modulée dans le mésencéphale ventral après l’intoxication par le MPTP. Toutefois une augmentation significative d’expression de l’intégrine Itgax (CD11c), marqueur des cellules dendritiques, a été détectée 2 et 7 jours après MPTP (2,5 et 5 fois respectivement, et significative à 7 jours, ANOVA sur les rangs, P<0,05).

Nous avons par ailleurs observé une augmentation de l’expression de TIMP1, inhibiteur de métalloprotéases, 2 jours après intoxication par le MPTP (augmentation de 4 fois, ANOVA sur les rangs, P<0,05).

Parallèlement à l’augmentation d’expression des facteurs chimiokiniques indiquée précédemment, il est intéressant de noter que nous avons également observé une augmentation d’expression significative du marqueur lymphocytaire T, CD3e, et de Tbx21 (T-bet), un marqueur des lymphocytes Th1, 7 jours après MPTP (Figure 30).

Figure 30 : Expression des marqueurs lymphocytaires dans le mésencéphale ventral de souris injectées avec une solution saline ou du MPTP. L’expression de CD3e et Tbx21 est significativement augmentée 2 jours après intoxication par le MPTP (ANOVA à 2 facteurs, §, P<0,05 vs contrôles).

Enfin, et pour conclure, nous observons dans l’ensemble une tendance à la diminution d’expression des récepteurs aux chimiokines 2 jours après intoxication par le MPTP. C’est le cas en particulier de CCR2, CCR3 et CXCR3.

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Afin de confirmer nos résultats, nous avons vérifié l’augmentation d’expression de CXCL10 sur l’ensemble des mésencéphales ventraux de souris intoxiquées pour les Oligoarrays et les TaqMan® Arrays. Ainsi, nous avons pu confirmer l’augmentation d’expression de CXCL10 par des expériences de qPCR sur un très grand nombre d’échantillons. De façon intéressante, nous avons observé une diminution progressive d’expression de CXCL10 à 5 et 7 jours post-MPTP (Figure 31).

Figure 31 Expression de CXCL10 dans le mésencéphale ventral de souris contrôle ou intoxiquées au MPTP issus des expériences d’oligoarrays et de TaqMan arrays. L’expression de CXCL10 est augmentée 2 jours après MPTP puis diminue progressivement jusqu’à 7 jours (ANOVA sur les rangs, *, P<0,05 vs contrôles).