Détection des chimiokines par immunomarquage

a) Présentation

Afin d’identifier l’origine cellulaire des chimiokines CCL3, CCL4 et CXCL10 dans la SNpc des animaux lésés au MPTP, nous avons réalisé des expériences d’immunomarquage multiple. Les marqueurs cellulaires étaient :

- La TH pour marquer les neurones dopaminergiques

- Iba1 (ionized calcium binding adaptor 1) pour marquer les microglies - La GFAP pour marquer les astrocytes

- PECAM1 pour marquer l’endothélium vasculaire

Cette étude a été réalisée sur le cerveau d’animaux sacrifiés 24 heures et 48 heures après l’intoxication au MPTP.

b) Résumé des principaux résultats

Tout d’abord nous avons pu mettre en évidence l’expression de CCL3 dans la SNpc à 1 et 2 jours après MPTP dans les cellules Iba1+ (Figure 36). Aucune colocalisation de CCL3 avec la TH, la GFAP et PECAM1 n’a été observée, suggérant une production exclusivement microgliale de ce facteur (Figure 37). Par ailleurs aucune cellule CCL3 positive n’était détectée dans la substance noire pars reticulata (SNpr), zone de l’arborisation dendritique des neurones dopaminergiques nigraux (Figure 36).

La spécificité du marquage a été confirmée par : i) une disparition du signal lorsque l’anticorps primaire est pré-absorbé avec la protéine recombinante et ii) une absence de marquage lorsque l’anticorps secondaire dirigé contre Iba1, PECAM1 et GFAP n’a été incubé qu’avec l’anticorps primaire anti-CCL3 (Figure 38).

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Figure 36 : Immunomarquages en fluorescence pour CCL3 (rouge), Iba1 (vert) et TH (bleu) dans la substance noire de souris intoxiquées au MPTP ou ayant reçu une solution saline. A : Un faible marquage CCL3 est observé dans la SNpc de souris salines. B : Un marquage CCL3 est observé dans les cellules Iba1+ de la SNpc, 1 jour post-MPTP. C : Un marquage CCL3 est observé dans les cellules Iba1+ de la SNpc, 2 jours post-MPTP. D : Agrandissement de l’encart rouge de l’image B, CCL3 est exprimé dans une cellule Iba1+. Barres d’échelle : A, B, C : 100 µm, D 20 µm.

Figure 37 : Immunomarquages en fluorescence pour CCL3 (rouge), GFAP et PECAM1 (vert), et TH (bleu) dans la substance noire de souris intoxiquées au MPTP ou ayant reçu une solution saline. A : CCL3 ne colocalise pas avec le marquage GFAP, 1 jour post-MPTP. B : CCL3 ne colocalise pas avec le marquage GFAP, 2 jours post-MPTP. C : CCL3 ne colocalise pas avec le marquage PECAM1, 1 jour post-MPTP. D : CCL3 ne colocalise pas avec le marquage PECAM1, 2 jours post-MPTP. Barres d’échelle : A, B, C, D : 100 µm.

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Figure 38 : Immunomarquages en fluorescence pour CCL3. A : L’anticorps primaire anti-CCL3 a été pré-adsorbé avec la chimiokine CCL3 recombinante. Le marquage CCL3 est fortement diminué. B : Les coupes ont été incubées avec l’anticorps primaire anti-CCL4 puis avec le secondaire dirigé contre l’anti-Iba1. Le marquage CCL3 n’est pas détecté. Barre d’échelle : A, B, 100 µm.

Concernant CCL4 nous avons observé des résultats similaires à ceux obtenus pour CCL3, à savoir, une expression exclusivement microgliale dans la SNpc (Figures 39 et 40). En raison d’une intensité de marquage plus faible pour CCL4, les images présentées ont été prises à l’objectif 25x. La spécificité du marquage est représentée en figure 41.

Ces résultats confirment l’expression des chimiokines CCL3 et CCL4 dans la SNpc de souris 48 heures après intoxication par le MPTP. Nous détectons également CCL3 et CCL4 dès 24 heures post-MPTP dans la SNpc. De plus nous avons observé une localisation microgliale de ces deux protéines.

Figure 39 : Immunomarquages en fluorescence pour CCL4 (rouge), Iba1 (vert) et TH (bleu) dans la substance noire de souris intoxiquées au MPTP ou ayant reçu une solution saline. A : Un faible marquage CCL4 est observé dans la SNpc de souris salines. B : Un marquage CCL4 est observé dans les cellules Iba1+ de la SNpc, 1 jour post-MPTP. C : Un marquage CCL4 est observé dans les cellules Iba1+ de la SNpc, 2 jours post-MPTP. D : Agrandissement de l’encart rouge de l’image B, CCL4 est exprimé dans deux cellules Iba1+. Barres d’échelle : A, B, C : 50 µm, D 20 µm.

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Figure 40 : Immunomarquages en fluorescence pour CCL4 (rouge), GFAP et PECAM1 (vert), et TH (bleu) dans la substance noire de souris intoxiquées au MPTP ou ayant reçu une solution saline. A : CCL4 ne colocalise pas avec le marquage GFAP, 1 jour post-MPTP. B : CCL4 ne colocalise pas avec le marquage GFAP, 2 jours post-MPTP. C : CCL4 ne colocalise pas avec le marquage PECAM1, 1 jour post-MPTP. D : CCL4 ne colocalise pas avec le marquage PECAM1, 2 jours post-MPTP. Barres d’échelle : A, B, C, D : 50 µm.

Figure 41 : Immunomarquages en fluorescence pour CCL4. A : L’anticorps primaire anti-CCL4 a été pré-adsorbé avec la chimiokine CCL4 recombinante. Le marquage CCL4 est diminué. B : Les coupes ont été incubées avec l’anticorps primaire anti-CCL3 puis avec le secondaire dirigé contre l’anti-Iba1. Le marquage CCL4 n’est pas détecté. Barre d’échelle : A, B, 50 µm.

S’agissant de CXCL10, nous avons également détecté son expression dans la SNpc après intoxication par le MPTP. Cependant le marquage n’était pas localisé sur l’ensemble de la SNpc mais sous forme de regroupements cellulaires (Figure 42). Des cellules doublement positives pour CXCL10 et la GFAP ont parfois été observées à la jonction de la SNpc et de la

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SNpr ou dans la SN pars lateralis (SNpl). Cependant au sein de la SNpc les cellules CXCL10+ ayant une forme astrocytaire étaient GFAP- ou GFAP faible (Figure 42). Aucune colocalisation de CXCL10 avec la TH, Iba1 et PECAM1 n’a été observée, suggérant une production exclusivement astrocytaire de ce facteur (Figure 43). Le contrôle avec pré-absorption montrait une diminution du marquage CXCL10 mais un bruit de fond élevé. Nous n’avons pas observé de marquage sur les coupes de tissu incubées avec l’anticorps primaire anti- CXCL10 plus l’anticorps secondaire dirigé contre la GFAP (figure 44).

Figure 42 : Immunomarquages en fluorescence pour CXCL10 (rouge), GFAP (vert) et TH (bleu) dans la substance noire de souris intoxiquées au MPTP ou ayant reçu une solution saline. A : Un faible marquage CXCL10 est observé dans la SNpc de souris salines. B : Un marquage CXCL10 est observé dans les cellules GFAP+ à la jonction de la SNpc et de la SNpr, 1 jour post-MPTP. C : Un marquage CXCL10 est observé dans les cellules GFAP+ de la SNpl, 2 jours post-MPTP. D : Agrandissement de l’encart rouge de l’image B, CXCL10 est exprimé dans une cellule GFAP+. Barres d’échelle : A, B, C : 100 µm, D 20 µm.

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Figure 43 : Immunomarquages en fluorescence pour CXCL10 (rouge), Iba1 et PECAM1 (vert), et TH (bleu) dans la substance noire de souris intoxiquées au MPTP ou ayant reçu une solution saline. A : CXCL10 ne colocalise pas avec le marquage Iba1, 1 jour post-MPTP. B : CXCL10 ne colocalise pas avec le marquage Iba1, 2 jours post-MPTP. C : CXCL10 ne colocalise pas avec le marquage PECAM1, 1 jour post-MPTP. D : CXCL10 ne colocalise pas avec le marquage PECAM1, 2 jours post-MPTP. Barres d’échelle : A, B, C, D : 100 µm.

Figure 44 : Immunomarquages en fluorescence pour CXCL10. A : L’anticorps primaire anti-CXCL10 a été pré-adsorbé avec la chimiokine CXCL10 recombinante. Le marquage CXCL10 est fortement diminué bien que du bruit de fond soit observé. B : Les coupes ont été incubées avec l’anticorps primaire anti-CXCL10 puis avec le secondaire dirigé contre l’anti-GFAP. Le marquage CXCL10 n’est pas détecté. Barre d’échelle : A, B, 100 µm.

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2.2.3. Confirmation de la localisation cellulaire par microscopie