En revanche, lorsque le faisceau incident présente une polarisation transverse au plan d’in- cidence, le champ électrique de l’onde évanescente se décompose selon deux orientations. L’une perpendiculaire au plan de l’échantillon que l’on note Ey, et une seconde dans le plan
de l’échantillon orientée selon l’axe z du schéma de la figure2.2(a). Ces deux composantes de champ se formulent par :
Ey= Eti 2 cosθi(sin2θi− n2)1/2 (n4cos2θ i+ sin2θi− n2)1/2 exp³i (δt+ π/2) ´ (2.4)
où Eitest l’amplitude du champ incident transverse et Ez= Eti 2 cosθisinθi (n4cos2θ i+ sin2θi− n2)1/2 exp(iδt) (2.5)
avec le terme de phaseδtdéfinie par :
δt= arctan µ (sin2θi− n2)1/2 n2cosθ i ¶ . (2.6)
Remarquons que dans le cas d’une illumination transverse, les composantes Ey et Ezsont
déphasées l’une par rapport à l’autre deπ/2. La polarisation de l’onde évanescente est donc elliptique. Néanmoins, comme l’intensité de la composante Ez est bien plus faible que Ey
(voir figure2.2(c)), la polarisation effective de l’onde évanescente est donc principalement orientée perpendiculairement à l’échantillon.
Pour résumer : une illumination TIRF permet un contrôle de la polarisation principale- ment dans les deux directions X et Y, une exaltation de l’intensité à la surface de l’échantillon, un confinement important du volume d’illumination, et un meilleur contraste d’intensité qui améliore la détection de molécules fluorescentes et la rend plus précise.
2.3 Système de mesure des durées de vie
La mesure de durée de vie d’un émetteur fluorescent se fait à partir d’un laser pulsé syn- chronisé avec un module de comptage de photons couramment appelé TCSPC (cf partie
1.2.1). Un SPAD, lui même relié au module TCSPC va détecter les photons de fluorescence de l’émetteur excité par un laser pulsé. Lorsqu’un photon entre en contact avec le volume ac- tif d’un détecteur, une paire électron-trou est créée. Ce volume étant soumis à une différence de potentiel, les porteurs de charges vont être accélérés, l’électron vers l’anode, et le trou vers la cathode. L’accumulation d’énergie cinétique par ces porteurs va, par un processus d’io- nisation en cascade, générer de nouveaux porteurs et donc amplifier le signal à détecter. La principale source de bruit sur ce type de détecteur est due aux électrons thermiques générés dans le volume actif de détection. Pour réduire ce bruit de fond, les SPADs que nous utilisons sont refroidis par un module Peltier. De plus, il est capital que les détecteurs soient maintenus dans un environnement sec car le refroidissement peut générer de la condensation sur les dé- tecteurs et les endommager. C’est pourquoi la ligne de SPADs est enfermée dans une chambre étanche sous une atmosphère d’azote, que nous purgeons périodiquement pour garantir un environnement sec au sein de la chambre.
La MLS comprend au total 32 SPADs de 50µm de diamètre, espacés de 250 µm (distance centre à centre). Huit SPADs contigus sont sélectionnés sur la base des spécifications requises (faible bruit de fond et peu de jitter) pour être connectés de manière indépendante à des mo- dules TCSPC. La figure2.3(a) montre une image du module de détection, et l’image 2.3(b)
FIGURE2.3 – (a) Module de détection de photon unique (SPADs). (b) Module TCSPC.
du module TCSPC. Cette technologie est développée par l’Institut Polytechnique de Milan en partenariat avec la société MPD (Micro Photonique Devices) [CUCCATOet collab.,2013].
Afin de caractériser notre montage, il est plus pertinent de reporter l’IRF (acronyme de l’anglais Instrument Response Function) de notre système plutôt que seulement le jitter de chaque détecteur, car la mesure du taux d’émission spontanée d’un émetteur fluorescent est convoluée par l’IRF. Pour extraire une mesure précise de ce dernier, il faut donc déconvoluer le signal de fluorescence par l’IRF. Les caractéristiques de nos détecteurs, mesurées dans des conditions expérimentales typiques avec la diode laser qui a été utilisée pour exciter l’échan- tillon dans les mesures de super-résolution qui seront présentées dans le chapitre3, sont re- portées dans le tableau suivant :
SPAD 1 2 3 4 5 6 7 8 IRF (ps) 98 99 93 93 110 92 99 104 Bruit (cps) 751 727 629 77 2082 573 218 302
TABLEAU2.1 – Valeur de l’IRF, et du bruit de fond pour chacun des huit SPADs reliés au module TCSPC, et refroidis à −5oC.
La distance minimale entre deux SPADs contigus (200µm) est soumise à des contraintes technologiques liées à l’encombrement des contacts électroniques. Afin de pouvoir augmen- ter considérablement le facteur de remplissage, ou filling factor, de la région conjuguée à l’échantillon sur laquelle se fait la détection, une ligne de microlentilles (Microlens Array Nr. 18-00047, SUSS-Optic) est placée en face des détecteurs à une distance de 1.1 mm. Les micro- lentilles ont un diamètre de 250µm, sont accolées, et ont une distance focale de fµ= 1 mm.
Chaque détecteur va imager une zone différente de l’échantillon. La taille de cette zone fait l’objet d’un compromis entre le champ de vue accessible à un SPAD et le bruit de fond causé par la présence de l’échantillon. En effet, comme les SPADs sont des détecteurs mono-
canaux, plus la zone de l’échantillon à imager est grande sur le SPAD, plus le bruit de fond provenant de l’échantillon est important. Sous ces conditions, nous avons choisi d’imager une zone d’environ 2.2µm de diamètre. Ce diamètre permet d’avoir accès à un champ de vue par SPAD suffisamment grand tout en ayant un bruit de fond relativement faible, entre 1500 et 3500 coups par seconde selon le SPAD concerné. Dans la section2.1nous avons discuté de la nécessité de n’avoir qu’une seule détection à la fois par SPAD. La taille du champ de l’échantillon de vu par un SPAD est donc également définie pour répondre à ce critère.