La lumière de fluorescence résultante de cette excitation est collectée par le même ob- jectif à immersion. Un miroir dichroïque et deux filtres interférentiels permettent de sépa- rer la lumière de fluorescence collectée par l’objectif de la lumière excitatrice. L’émission de fluorescence est ensuite divisée en deux par un miroir semi-réfléchissant. Une moitié du rayonnement de fluorescence est dirigée vers une caméra (iXon Ultra, Andor) de type EMCCD (acronyme pour Electron-multiplying Charge-Coupled Device). L’autre moitié est dirigée sur une matrice de microlentilles alignée devant la MLS. Chacun des SPADs formant la MLS est connecté à une électronique TCSPC (acronyme anglais pour Time Correlated Photon Coun-
ting) embarquée sur un module de comptage. Ce dispositif, conçu et fourni par Ivan Rech et
Angelo Gulinatti (Politecnico di Milano) dans le cadre d’une collaboration, est un prototype unique en son genre qui n’est pas encore commercialisé. Plus de détails sur le détecteur et la ligne de microlentilles seront donnés dans les sections2.3et2.5.
Dans cette configuration expérimentale, la lumière de fluorescence d’un émetteur unique peut être simultanément détectée par l’EMCCD et l’un des 8 SPADs, à condition que l’émet- teur sur l’échantillon soit dans le champ de vue des deux instruments. En utilisant la tech- nique de super-localisation (cf partie1.4.3), la position de l’émetteur de photons uniques sur l’échantillon peut être déterminée à partir de l’EMCCD. La mesure du SPAD va nous rensei-
FIGURE2.1 – Schéma du dispositif expérimental.Fc, FT et FLindiquent respectivement la lentille uti-
lisée pour focaliser le laser d’excitation dans le plan focal arrière de l’objectif, la lentille de tube et la lentille pour focaliser le faisceau sur la ligne de microlentilles.
gner sur la dynamique temporelle de l’émetteur et nous permettre de réaliser une mesure du taux de déclin à l’échelle d’un fluorophore unique. Comme les SPADs sont des détecteurs monocanaux, il est crucial de détecter un seul fluorophore par SPAD à la fois. Si plusieurs émetteurs étaient détectés simultanément par le même SPAD, il serait impossible d’avoir une mesure fiable de la durée de vie de chaque émetteur. Dans la partie2.7nous expliquerons comment et sous quels critères une détection de molécule fluorescente est conservée ou non. La différence fondamentale entre ce montage expérimental et celui présenté dans la sec- tion1.4.5est l’ajout de la MLS. Grâce à cette innovation, le champ de vue effectif de l’expé- rience a pu être augmenté d’environ un facteur 10 par rapport aux travaux de thèse de Dorian Bouchet. L’utilisation de la MLS a nécessité de modifier le chemin optique de détection (cf partie2.4), ainsi qu’une refonte profonde des algorithmes d’acquisition et d’analyse des don- nées. Ces modifications seront présentées en détail dans les parties2.6et2.7de ce chapitre.
La première version de l’expérience utilisait une illumination laser en incidence normale sur l’échantillon. Nous allons discuter dans la partie suivante des avantages apportés par l’illumination de type TIRF que nous avons adopté dans cette thèse.
2.2 Illumination en réflexion totale interne
Comme décrit précédemment, les molécules fluorescentes à la surface de l’échantillon sont illuminées par le faisceau laser avec un angle proche de la réflexion total interne. Ce type
d’illumination, couramment utilisé en microscopie de super-résolution, présente deux avan- tages. Premièrement, le rapport signal sur bruit d’une émission de fluorescence est meilleur que sous une illumination en incidence normale. Deuxièmement, il est possible de contrô- ler la polarisation de l’excitation à la surface de l’échantillon dans deux plans qui sont per- pendiculaires l’un à l’autre et qui ne sont pas accessibles avec une illumination en incidence normale.
Pour qu’il y ait réflexion totale interne, l’angle de réfraction doit être égal à 90°. En im- plémentant cette condition dans la loi de Snell-Descartes, l’angle critique de réflexion total interne est défini parθC = arcsin(nnvs) avec ns l’indice optique de la solution dans laquelle
baignent les molécules et nvl’indice optique de la lamelle de verre. Pour que cet angle critique
puisse exister, les indices optiques doivent vérifier la relation ns< nvsans quoi la réflexion to-
tale interne est impossible.
FIGURE2.2 – (a) Schéma de l’illumination en TIRF à travers l’échantillon.(b) Distance de pénétration de l’onde évanescente dans la solution tampon (pour une longueur d’onde d’illumination de 642 nm). (c) Intensité relative des composantes du champ évanescent à la surface de l’échantillon pour les deux orientations de polarisation du faisceau incident : courbe bleue (orange et jaune) pour une polarisation parallèle (transversale) au plan de l’échantillon (ns= 1.33 et nv= 1.5). Les lignes en pointillés noirs sur
les deux graphiques symbolisent la position de l’angle de réflexion totale interne.
Le TIRF consiste à illuminer la surface de l’échantillon avec un faisceau laser de manière à ce que la totalité du faisceau soit réfléchie par l’interface verre/solution comme schématisé sur la figure2.2(a). Sous une illumination en réflexion totale interne, une onde évanescente est générée à la surface de l’échantillon. Cette onde évanescente s’étend dans la solution sur quelques centaines de nanomètres (cf graphique2.2(b)). L’extension spatiale de l’onde éva-
nescente est définie par [MARTIN-FERNANDEZet collab.,2013] :
d =λ0
4π(n
2
vsin2(θi) − n2s)−1/2 (2.1)
avecλ0 la longueur d’onde du faisceau incident etθi son angle d’incidence. La distance de
pénétration de l’onde dans la solution tampon est indépendante de la polarisation incidente, mais dépend en revanche de la longueur d’onde et de l’angle d’incidence. Sous une illumi- nation TIRF, le volume dans lequel est confiné le champ optique au niveau de la surface de l’échantillon est plus petit qu’avec une excitation normale. La faible extension spatiale dans la direction y fait que l’onde évanescente va exciter uniquement les objets fluorescents proches de la surface. Cette technique d’illumination réduit drastiquement le bruit de fond causé par la lumière de fluorescence issue des plans situés au dessus de la surface de l’échantillon, et améliore donc le ratio signal sur bruit par rapport à une illumination en incidence normale. Nous allons voir dans la suite que le confinement de la lumière permet également d’avoir une intensité du champ à la surface de l’échantillon plus élevée sous ce type d’illumination qu’avec une illumination en incidence normale.
Le faisceau laser incident peut présenter deux polarisations caractéristiques, une polarisa- tion parallèle à la surface de l’échantillon, notée Epi, ou bien transverse, notée Eti. En fonction de la polarisation et de l’angle d’incidence du faisceau laser, l’intensité des composantes du champ évanescent ne vont pas être les mêmes. Lorsque le faisceau incident est polarisé pa- rallèlement à la surface de l’échantillon, la polarisation du champ évanescent est entièrement définie selon l’axe x. Elle a pour expression [MARTIN-FERNANDEZet collab.,2013] :
Ex= Epi
2 cosθi
(1 − n2)1/2exp(−i δp), (2.2)
avecθi l’angle d’incidence, n = nns
v le rapport des indices optiques des deux interfaces, E
p i
l’amplitude du champ incident, etδple facteur de phase défini comme :
δp= arctan
³(sin2θi− n2)1/2 cosθi
´