Système d'injection

II.1.4. Détection

II.2. Couplage avec la spectrométrie de Masse (GC-MS) II.2.1. Système d'introduction de l'échantillon II.2.2. Source d'ionisation

II.2.3. Analyseur quadripolaire

II.3. Applications de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à l’analyse des acides organiques

II.3.1. Préparation d’échantillons II.3.1.1. Echantillon urinaire II.3.1.2. Extraction

II.3.2.3. Dérivation

II.3.2. Analyses actuelles en chromatographie en phase gazeuse II.4. La chromatographie gazeuse bidimensionnelle

II.4.1. Principe

II.4.2. Système de chromatographie gazeuse bidimensionnelle II.4.2.1. Modulation

II.4.2.2. Colonnes II.4.2.3. Détection

II.4.3. Applications de la chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle à l’analyse des acides organiques

32 « La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse est, malgré une étape de préparation d’échantillon contraignante, une des techniques analytiques les plus utilisées pour l'étude de composés organiques. Cette méthode d'analyse est incontournable pour les analyses de métabolites urinaires spécifiquement liés à de nombreuses erreurs innées du métabolisme, notamment l’acidémie organique. »

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II.1. LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (GC)

La chromatographie en phase gazeuse (GC) est une technique analytique séparative fréquemment utilisée pour la caractérisation et l'identification des composés organiques volatils et semi-volatils.

Le principe fondamental de la séparation GC se trouve sur le partage des composés entre une phase mobile qui est un gaz vecteur inerte et une phase stationnaire solide ou liquide, qui est immobilisée à l'intérieur de la colonne chromatographique. Le mécanisme de séparation est dynamique ; les molécules passent continuellement d’une phase à l’autre, ce qui crée un état d’équilibre entre la phase mobile et la phase stationnaire pour un constituant en particulier.

La séparation des composés dépend de plusieurs paramètres:

 La température : Généralement, si les constituants du mélange à séparer ont des polarités voisines, les composés les plus volatils sont les plus rapidement entraînés. Lorsque l'écart entre les points d'ébullition des constituants du mélange à séparer est grand, il est préférable de faire un gradient de température.

 Le débit du gaz vecteur : Il doit être tel que les différents constituants du mélange puissent s'équilibrer entre la phase mobile et la phase stationnaire. Si le débit est trop rapide, la séparation des pics est médiocre. S’il est trop lent, les pics perdent leur finesse par suite d'une diffusion trop importante des constituants dans le gaz vecteur.

 La nature de la phase stationnaire : La polarité d’une phase stationnaire désigne sa propension à développer des interactions spécifiques par effets électroniques, stériques ou chiraux. En GC, le facteur de rétention d’un soluté est inversement proportionnel au produit de sa tension de vapeur et de son coefficient d’activité dans la phase stationnaire à dilution infinie. Donc, pour séparer des substances polaires, on utilise une phase polaire car ces substances

34 seront fortement retenues; dans ce cas, l’ordre de sortie des composés d’une série d’homologues est l’ordre croissant de leur point d’ébullition. Si des composés peu polaires se trouvent dans le mélange analysé, ils sont peu retenus par la phase stationnaire polaire et sont élués avant les composés polaires ayant le même point d’ébullition. Si la phase stationnaire est apolaire, c’est l’inverse qui se produit.

Les composants essentiels d'un système de GC sont : le gaz vecteur, le système d'injection, la colonne d'analyse dans un four à température contrôlée et le système de détection qui est relié à un système d’enregistrement et de traitement de données (Figure II.1).

Figure II.1. Système de chromatographie en phase gazeuse (GC).

Injecteur

Gas vecteur ^{Colonne dans le four}

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II.1.1 Le gaz vecteur

Le gaz vecteur est la phase mobile. C’est dans ce flux qu’on injecte un mélange à analyser et c’est lui qui le véhicule jusqu'à un détecteur à travers une colonne. Le gaz vecteur doit être insoluble dans la plupart de liquides, inerte vis-à-vis des solutés et des phases stationnaires et être pur, c'est-à-dire exempt d'eau et d’oxygène qui pourraient réagir avec la phase stationnaire. L'hydrogène, l’hélium, l’azote et les gazes rares répondent à ces différents critères.

La viscosité du gaz augmente quand la température croît. Le gaz vecteur doit avoir une très faible viscosité. La viscosité ou le débit de gaz ont une influence sur la dispersion dans la colonne, donc sur l’efficacité et la sensibilité de la détection.

L’optimum d’efficacité d’une colonne pour une température donnée est obtenu quand la vitesse du gaz vecteur se place au minimum de la courbe de Van Deemter. Pour avoir des analyses sans perte de résolution des pics il est souhaitable d'avoir une courbe de Van Deemter de faible pente après le point optimum. Parmi les gaz préalablement cités, l'hélium est le gaz permettant de travailler avec une vitesse de circulation relativement grande sans perdre en efficacité. Si on veut travailler à hautes températures, l’hydrogène est plus favorable aux grandes vitesses que l’hélium. Dans la pratique beaucoup de laboratoires préfèrent utiliser l'hélium plutôt que l'hydrogène pour des raisons de sécurité. L'hélium permet un bon compromis entre l’efficacité/ sécurité/ temps d’analyse.

II.1.2. Système d’injection

L'injection de l'échantillon est la première étape dans le processus chromatographique. La technique utilisée est un facteur important et doit permettre le transfert reproductible et quantitatif de l'analyte dans la colonne, de minimiser l'élargissement des pics chromatographiques, la décomposition des composés et l'adsorption au niveau de l’injecteur [Yuwono et Indrayanto, 2004]. L’échantillon, sous

36 forme liquide ou gazeuse, est introduit en tête de colonne via un système d’injection. Dans le cas d’un échantillon liquide, le mélange est introduit à l’entrée du système via une seringue et la température imposée au système d’injection doit prendre en compte la température d’ébullition du composé le moins volatil pour permettre la vaporisation totale de l’échantillon. Les composés analysés en GC doivent donc être volatils et stables thermiquement.

Les techniques d'injection les plus communes sont l’injection en mode « split » (avec division de flux), en mode « splitless » (sans division de flux) et l’injection « On column » [Grob, 1980].

 En mode split, qu’une fraction de l'échantillon injecté, déterminée par le split ratio, pénètre dans la colonne, tandis que le reste est évacué. Ce mode d’injection est la technique de choix pour un échantillon concentré mais ne convient pas pour l'analyse de traces.

 En mode splitless, la quasi-totalité de la vapeur de l'échantillon est transférée dans la colonne. Ce mode est utilisé pour l'analyse de composés à l'état de traces, quand il est nécessaire de transférer une quantité maximale d'échantillon dans la colonne, afin de maximiser la sensibilité.

 L'injection "on column", consiste à introduire directement l’analyte en solution dans la colonne ou dans une pré-colonne (dont la fonction est de permettre l'injection d'un grand volume d'échantillon et/ou de protéger la colonne analytique d'éventuels polluants matriciels) à température ambiante. Ce mode d’injection est utilisé dans le cas de composés thermolabiles, qui sont directement introduits dans la colonne via un port d'injection froid puis sont vaporisés rapidement par un chauffage programmé.

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