1.6.1 Synthèse chimique classique en solution
Dans le cadre de mes recherches, deux méthodes de synthèse chimique ont été utilisées. La première est la synthèse chimique classique en solution. Cette méthode a été utilisée pour modifier le cycle D du noyau stéroïdien androstane du composé 1, de l’epi-ADT ou du 5α-DHT (Figure 8). Ce type de synthèse peut être convergente, puisqu’un même intermédiaire obtenu après quelques étapes peut subir diverses réactions chimiques produisant différents dérivés. De plus, contrairement à la chimie sur support solide, il est possible de caractériser les produits intermédiaires après chaque étape d’une séquence de réactions. Les produits, après purification sur gel de silice, sont alors caractérisés par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H) et du carbone (RMN 13C), par la spectrométrie de masse et infrarouge, alors que la pureté est évaluée par HPLC (chromatographie liquide haute performance). Les réactions chimiques utilisées pour obtenir les différents dérivés stéroïdiens ont été adaptées de celles publiées précédemment par notre laboratoire.139,166,170-176
1.6.2 Synthèse chimique en parallèle sur support solide
La seconde méthode employée pour la préparation de molécules est la synthèse chimique en parallèle sur support solide. Dans notre cas, le noyau stéroïdien 3α-hydroxy-3β- pipérazinylmethyl-5α-androstan-17-one est greffé sur une résine polystyrène fonctionnalisée par un espaceur diol au moyen d’une réaction d’acétalisation (Figure 9).170 Par la suite, le
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de le dériver, c’est-à-dire ajouter différents groupements fonctionnels. En utilisant cette méthode, la purification des produits synthétisés est simplifiée puisqu’il suffit de laver la résine insoluble avec divers solvants organiques pour enlever tous réactifs et produits secondaires non liés à la résine.177,178 Lorsque clivés de la résine, les produits obtenus sont caractérisés par RMN 1H, par spectrométrie de masse tandis que la pureté est évaluée par HPLC. Cette méthode de synthèse est utile pour obtenir rapidement un grand nombre de dérivés de pureté suffisamment élevée pour effectuer des études biologiques. Par exemple, notre résine fonctionnalisée a été mise en condition réactionnelle de couplage peptidique (voir chapitre 2, Figure 3) afin d’obtenir plus de 40 dérivés de type amides en utilisant différents acides carboxyliques. Par le fait même, l’obtention de ces produits ainsi que leur évaluation biologique permet d’établir des relations entre la structure chimique de la molécule et son activité biologique, et ainsi orienter la synthèse de nouveaux produits similaires. Toutefois, il faut souligner que lorsqu’un produit donne des résultats intéressants lors des rondes de criblage biologique, sa synthèse par chimie classique en solution est effectuée par la suite, pour obtenir un produit ayant une plus grande pureté et reconfirmer les résultats biologiques.
Figure 9. Conditions pour l’addition du dérivé stéroïdien 3α-hydroxy-3β-pipérazinylmethyl-5α-androstan-17- one sur la résine polystyrène fonctionnalisée par un espaceur diol.
1.6.3 Essai enzymatique d’inhibition
Afin d’évaluer le potentiel d’inhibition des composés synthétisés, des essais enzymatiques et en cellules sont utilisés. Dans le cadre de ces essais, le composé en solution est mis sous incubation avec la source enzymatique et son substrat radiomarqué. Après un temps donné, le substrat et le produit de la réaction enzymatique sont extraits, et leur proportion mesurée. Au moyen d’un blanc (ne contenant pas de source enzymatique) et d’un contrôle (aucun inhibiteur), les taux de transformation du substrat, et par le fait même les pourcentages d’inhibition d’un composé donné, peuvent être calculés.142,165
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Dans le cadre de mes recherches, deux sources enzymatiques ont été utilisées: l’enzyme purifiée ainsi que des cellules surexprimant ou non l’enzyme étudiée. Tout d’abord, la 17β-HSD10 purifiée, provenant d’une source commerciale, a été utilisée dans certains essais biologiques. L’utilisation de l’enzyme purifiée nécessite l’ajout du cofacteur, dans le cas présent le NAD+, pour que la réaction enzymatique se produise.147 La deuxième source enzymatique était des cellules intactes HEK-293 et LNCaP qui furent transfectées par des collaborateurs. La transfection des cellules est en fait l’augmentation de l’expression d’une protéine, dans le cas présent la 17β-HSD10 humaine, en introduisant chez une cellule native, dite « wild-type », un vecteur portant le gène codant pour l’enzyme cible.179 Donc, les
cellules surproduisent l’enzyme ciblée. Ainsi, les cellules HEK-293 surexprimant la 17β- HSD10 peuvent être utilisées pour mesurer les taux de transformation de l’E2 en E1 et les taux d’inhibitions provoqués par les composés étudiés.165 Dans un même ordre d’idée, les
cellules LNCaP surexprimant la 17β-HSD3 sont utilisées pour mesurer l’inhibition de la transformation du 4-dione en T.142 Ces cellules du cancer de la prostate sont androgéno- dépendantes et possèdent un récepteur des androgènes mutés.180 Finalement, il est possible d’utiliser des cellules non transfectées comme source enzymatique. Pour la deuxième section de mon projet de recherche, des cellules LAPC-4 sont utilisées pour évaluer le potentiel inhibiteur de divers composés sur la transformation du 3α-diol en 5α-DHT. Toutefois, l’enzyme cible des inhibiteurs n’est pas connue dans ce modèle. Des études plus approfondies seront nécessaires pour identifier la ou les enzymes qui transforment le 3α-diol dans les cellules LAPC-4, des cellules du cancer de la prostate androgéno-dépendantes et dont le récepteur des androgènes est natif.181
Il est important de souligner que l’introduction d’une enzyme dans une cellule qui ne possède pas naturellement les enzymes transformant le substrat étudié permet de mesurer les taux de transformation provoqués uniquement par l’enzyme transfectée. Les études dans un modèle cellulaire permettent d’ailleurs de se rapprocher de la réalité du modèle animal et de discriminer déjà certains inhibiteurs potentiels. Par exemple, un composé peut être un bon inhibiteur lorsque l’enzyme seule est employée, mais être inutile en milieu cellulaire puisqu’il ne parvient pas à pénétrer la membrane cytoplasmique de la cellule.
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1.6.4 Évaluation biologique de la stabilité métabolique
Afin d’évaluer la stabilité métabolique d’un composé, soit sa capacité à résister à des réactions de métabolisation, divers protocoles peuvent être utilisés. Dans le cas présent, un essai enzymatique utilisant une fraction microsomale de foies humains est effectué.182 La concentration du composé est mesurée par dosage HPLC, après une heure d’incubation en présence des microsomes avec ou sans le cofacteur NADPH essentiel aux réactions enzymatiques. Le pourcentage de composé restant peut être calculé et comparé aux autres produits soumis à l’essai. Dans cet essai, des réactions de métabolisation de niveau 1, soit d’oxydation, de réduction et d’hydrolyse, se produisent.183,184