Synthèse, position du problème et objectif de l’étude

l’étude

Cette étude bibliographique jette la lumière sur la complexité de la réaction de

trans-formation de la lignocellulose en sucres simples par le moyen de cocktails enzymatiques.

Cette complexité se manifeste au niveau de la nature et des interactions au sein des

systèmes enzyme-substrat et a comme conséquence directe la difficulté d’isoler et de

quantifier expérimentalement l’effet d’un paramètre sur l’ensemble du système malgré le

I.8. Synthèse, position du problème et objectif de l’étude

recours à des techniques de plus en plus poussées.

L’hétérogénéité des substrats lignocellulosiques tant au niveau de leur composition

(fractions lignine, hémicellulose et cellulose) que de leur structure (répartition des fractions

lignine et hémicellulose, degré de cristallinité, porosité . . .) rend sa caractérisation délicate.

Un grand nombre de techniques expérimentales sont proposées et ont été utilisées à la

fois pour qualifier et quantifier ces différents aspects et leur évolution durant la réaction.

Chaque technique, de par son principe physique et de par sa mise en œuvre aboutit à un

type de données spécifiques qu’il convient d’interpréter avec précaution en se replaçant

dans le contexte de l’étude afin d’éviter de tirer des conclusions hâtives. La cristallinité à

titre d’exemple illustre bien cette dépendance à la technique de mesure comme mentionné

auparavant. Cela est à dissocier bien évidemment de la qualité intrinsèque de la mesure

qui est aussi un point très important.

Au-delà des facteurs liés aux propriétés du substrat, la nature des enzymes utilisées

conditionne bien sûr la vitesse de l’hydrolyse. Les cocktails enzymatiques sont composés

de différentes enzymes distinctes ayant chacune son mode d’action et sa sensibilité à

l’en-vironnement. L’action coopérative des enzymes aboutit à la modification progressive des

propriétés du substrat et du milieu réactionnel. Ce double impact se met en place et se

répercute sur l’ensemble du système y compris sur les enzymes elles-mêmes (FigureI.12).

En effet, la réactivité du substrat diminue dans le temps puisque les fractions facilement

hydrolysables sont converties préférentiellement et l’accessibilité chute. Simultanément,

les concentrations en sucres simples dans le milieu réactionnel augmentent et inhibent

les différentes activités enzymatiques. Comme conséquence directe de cette dynamique

complexe du système, la vitesse globale de la réaction de transformation chute

progressi-vement sans atteindre des taux de conversion satisfaisants même à des temps longs et à

des charges en biocatalyseur importantes.

Le passage à l’échelle d’un procédé avec les contraintes que cela impose (design, type

d’alimentation, hydrodynamique . . .) nécessite le développement d’un modèle fiable qui

puisse apporter des réponses à l’ensemble de ces questionnements. Les modèles les plus

utilisés dans la littérature sont basés sur des schémas cinétiques de type Michaelis-Menten

ou d’adsorption en mode batch. La structure de ce type de modèles est simple avec une

seule variable à savoir la concentration du substrat en phase liquide quelque soit son

FigureI.12 – Schéma global de l’hydrolyse enzymatique : conséquences sur le substrat et

les enzymes.

état (soluble, particulaire, composition, taille . . .) et un certain nombre de paramètres

globaux accessibles expérimentalement via un fitting de données typiques d’hydrolyse

(évolution temporelle des concentrations en sucres produits). Pour gérer la complexité

liée aux différents facteurs limitants, de nouveaux paramètres sont rajoutés aux modèles

sans toutefois changer leur structure profonde. C’est le cas par exemple pour les effets

d’inhibition, d’adsorption ou de désactivation. Néanmoins, rajouter l’adsorption, par

exemple, sans disposer d’une information sur l’état et les propriétés du substrat n’a pas

beaucoup de sens d’autant plus que ce substrat subit des modifications morphologiques

et structurales importantes durant la réaction. De ce fait, la fiabilité de tels modèles est

très limitée et ceux-ci perdent leur capacité prédictive et leur pertinence hors de leurs

conditions d’établissement.

Se rendant compte du défaut structurel de ces modèles cinétiques, des tentatives

pour proposer des approches qui se basent sur une ou plusieurs propriétés du substrat

et/ou du biocatalyseur sont développées. La difficulté dans ce cas réside à la fois dans

le choix de(s) la propriété(s) et dans la profondeur à laquelle le problème est traité

puisque cela conditionne non seulement l’aspect expérimental (besoin de techniques

appropriées pour alimenter le modèle et le valider) mais aussi l’aspect mathématique

(besoin d’un outil suffisamment avancé et robuste pour accompagner ces choix). En

effet, une description sommaire du système génère les mêmes insuffisances qu’avec les

approches classiques (MM et adsorption) et une description fine de la réaction comme

I.8. Synthèse, position du problème et objectif de l’étude

dans le cas des modèles stochastiques requiert un formalisme mathématique complexe (et

pas toujours compatible pour le changement d’échelle et les diverses interactions entre les

composantes du système) et des moyens expérimentaux très lourds à mettre en œuvre.

Compte tenu de toutes ces considérations, l’objectif de ce travail est de développer

un modèle générique pour décrire la réaction d’hydrolyse enzymatique de la cellulose qui

prend comme variable la distribution de taille des particules/chaines du substrat (une

hétérogénéité structurale) et comme paramètres les activités enzymatiques élémentaires.

Le choix de la variable taille pourrait permettre de gérer avec efficacité la dynamique du

système en intégrant les phénomènes limitants (e.g. évolution de la surface développée)

d’une façon appropriée.

Le challenge étant de disposer d’un outil suffisamment avancé pour décrire l’action

des enzymes et les conséquences sur les propriétés du substrat, suffisamment flexible

pour intégrer l’ensemble des processus élémentaires et aborder les questions relative à

la conception optimale d’un procédé. Pour cela, nous avons choisi de nous appuyer sur

le formalisme de bilan de population. Cette approche a montré sa puissance dans la

mo-délisation des systèmes dispersés (e.g. cristallisation, extraction liquide-liquide, systèmes

diphasiques gaz-liquide) et offre une ouverture pour des extensions selon le besoin (e.g.

couplage avec l’hydrodynamique, rajouter une ou plusieurs variables). Nous avons donc

choisi de mettre en œuvre les outils éprouvés du Génie des Procédés pour traiter du cas

de systèmes réactifs à phase dispersée (catalyse hétérogène, bilan de population) et d’y

intégrer les connaissances spécifiques de la biocatalyse enzymatique.

Le développement de ce modèle se décline en deux grandes parties. La première partie

est dédiée aux développements mathématiques à la fois analytiques et numériques

né-cessaires à la formulation et à la résolution du bilan de population dans le contexte de

l’hydrolyse enzymatique. La deuxième partie est consacrée à la métrologie nécessaire pour

alimenter le modèle et le confronter à l’expérience.

Chapitre II

Matériel et méthodes expérimentales

Comme mentionné dans le Chapitre I, cette étude comporte un volet expérimental

visant à alimenter la partie modélisation. Ce chapitre est donc consacré à la description

de cette partie expérimentale.

Nous abordons en premier lieu le dispositif expérimental à savoir les conditions

géné-rales de conduite des expériences, le(s) substrat(s) et les enzymes utilisés. En deuxième

lieu, une description des outils de caractérisation biochimique et physique est donnée.

L’accent sera mis sur l’interprétation des données expérimentales selon l’outil utilisé.

II.1 Dispositif expérimental

Les expériences d’hydrolyse sont conduites dans un réacteur muni d’une double

en-veloppe (pour la régulation thermique) de volume utile de 0.5 L et d’un couvercle pour

minimiser l’évaporation. Pour s’affranchir de l’effet des conditions opératoires, celles-ci

restent fixes autour de leurs valeurs optimales pour l’ensemble des expériences. La vitesse

d’agitation est fixée à 200 rpm en utilisant un agitateur à quatre pales inclinées. La

tem-pérature est régulée autour de 40 ˚C à l’aide d’un thermostat en faisant circuler de l’eau

chaude dans l’enveloppe du réacteur. Nous avons utilisé une solution tampon acétate 50

mM pour maintenir le pH à 4.8. De plus, une sonde pH et un thermomètre sont utilisés

pour s’assurer que la température et le pH restent constant durant la réaction. Pour éviter

le développement bactérien dans le milieu réactionnel, les solutions sont supplémentées

avec de l’azide de sodium (N aN

₃

) à 0.1 % massique. Dans l’ensemble des expériences,

sauf mention spécifique, la concentration en substrat est de 1 % massique et la durée est

de 144 h.

Pour le suivi de la réaction d’hydrolyse, des prélèvements séquentiels sont réalisés

des-tinés aux différentes analyses physiques et biochimiques qui seront décrites ultérieurement.

Un suivi in-situ et en continu de l’évolution de la distribution de taille des particules du

substrat est assuré par une sonde FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement). Le

schéma global du dispositif expérimental est donné dans la Figure II.1.

FigureII.1 –Dispositif expérimental utilisé pour la conduite des expériences d’hydrolyse

Pour bloquer l’action des enzymes, les prélèvements destinés aux différentes analyses

sont plongés directement dans de l’eau bouillante (T > 90 ˚C) pendant 10 mn et

centri-fugés à 2000 g pendant 10 mn pour séparer les phases liquide et solide si nécessaire avant

d’être stockés à -20 ˚C.

Dans le document Modélisation de l’hydrolyse enzymatique de substrats lignocellulosiques par bilan de population (Page 73-80)