Caractérisation physique et physico-chimique du substrat

Comme discuté dans la première partie, la nature et les propriétés du substrat jouent

un rôle capital lors de l’hydrolyse enzymatique, raison pour laquelle une caractérisation

fine et multi-échelle est nécessaire. Une panoplie de techniques expérimentales issues de

différents domaines scientifiques sont adaptées et utilisées.

I.6.2.1 Composition du substrat

Pour remonter à la composition d’un substrat (fractions lignine, hémicellulose et

cellulose), une hydrolyse acide complète (à l’acide sulfurique) est généralement réalisée

(suivant le protocole décrit dans (Sluiter et al., 2007) par exemple). L’hydrolysat est

analysé par HPLC pour la détermination des concentrations en sucres simples et donc la

teneur en cellulose et hémicellulose. La fraction insoluble est constitué majoritairement

de lignine (en plus des cendres et des protéines insolubles). La partie de lignine solubilisée

est déterminée par spectroscopie UV-visible (Chauve, 2011). Cette méthode destructive

donne une information exclusivement quantitative sur la composition du substrat et

I.6. Outils de caractérisation

nécessite des temps longs (au minimum un jour).

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) est une alternative

pro-metteuse qui attire de plus en plus de recherches. Cette technique d’analyse non

des-tructive est basée sur l’interaction rayonnement-matière dans le domaine infrarouge (IR :

longueur d’onde entre 0.7 et 50 µm) puisque la majorité des molécules organiques et

inorganiques vibrent à des fréquences identiques à celles de l’IR (généralement dans le

moyen IR : longueur d’onde entre 2.5 et 25 µm). La substance étudiée est irradiée avec

un faisceau ayant des longueurs d’onde connues et le faisceau réfléchi ou transmis est

analysé. Les éléments chimiques de la substance (composition et nature des liaisons

inter-et intra-moléculaires) absorbent à des longueurs d’onde spécifiques inter-et laissent ainsi leur

empreinte sur le faisceau en sortie (Essendoubi, 2007). Dans le cas de la lignocellulose

(substrat solide), l’analyse par réflexion (généralement en mode ATR : Attenuated Total

Reflectance) est utilisée.

Adapa et al. proposent une étude bibliographique sur les fréquences d’absorption des

constituants de lignocelluloses d’origines différentes (pailles de blé et d’orge, sons de maïs

et d’avoine, . . .) (Adapa et al., 2009). Les composés aromatiques de la lignine absorbent

autour d’une fréquence de 1510 cm

⁻¹

(Stewart et al., 1995a; Yu, 2005) alors qu’une

mul-titude de fréquences sont caractéristiques de la cellulose (selon la liaison considérée et

le type de vibration) (Chen et al., 1997; Yu, 2005; Schulz & Baranska, 2007). Très peu

d’études sont dédiées par contre à l’hémicellulose (Chen et al., 1997;Schulz & Baranska,

2007). Si la majorité des études sont qualitatives, une poignée tente d’exploiter

l’inten-sité des pics d’absorption caractéristiques avec différentes méthodes pour remonter aux

fractions des trois constituants notamment le taux de lignine (Faix, 1988; Emandi et al.,

2011).

Les atouts de cette méthode sont sa rapidité, les quantités négligeables de substrat

qu’elle nécessite et la simplicité du protocole expérimental. En contre partie, l’exploitation

des spectres est une tâche complexe. L’information produite concerne la composition en

surface en un point, ce qui peut poser problème dans le cas d’un substrat hétérogène.

I.6.2.2 Degré de polymérisation et distribution de taille

Le degré de polymérisation moyen d’un substrat cellulosique peut être déterminé en

mesurant sa viscosité intrinsèque une fois dissout dans un solvant organo-métallique tel

que la cupri-éthylène-diamine (CED). Evans et al. donnent le DP moyen en fonction de

la viscosité intrinsèque selon la corrélation suivante (Evans & Wallis, 1989) :

DP

^0.9

= 1.65·[η] (I.2)

Avec η la viscosité intrinsèque en mL.g

⁻¹

.

Dans le cas d’un substrat soluble, la distribution de la masse molaire des chaines

cellulosiques (MMD : Molar Mass Distribution) donne une information complète sur les

tailles des polymères présents en solution et peut être atteinte en utilisant la

chromato-graphie d’exclusion stérique (SEC : Size-Exclusion Chromatography). Cette technique de

séparation des macromolécules en solution est généralement couplée à différents types de

détecteurs (réfractomètre différentiel, spectromètre UV, détecteur à diffusion de lumière

multi-angles MALLS, . . .) (Saakeet al., 2001; Schultet al., 2002; Eremeeva, 2003). Cette

technique peut être utilisée pour le suivi de l’évolution de la MMD durant la réaction

d’hydrolyse enzymatique (Kleman-Leyer et al., 1994; Chen et al., 2007b; Zhang et al.,

2011). A partir de la MMD, la masse molaire moyenne en nombre (équation I.3) et/ou

en volume (équationI.4) peuvent être estimées, ce qui permet de remonter au DP moyen

via la masse molaire du motif élémentaire.

M

_n

=

P

n

_i

M

_i

P

n

_i

(I.3)

M

_w

=

P

n

_i

M

_i²

P

n

_i

M

_i

(I.4)

Avec M

_i

la masse molaire du polymère i etn

_i

sa fraction en nombre.

Dans le cas d’un substrat particulaire, la distribution de taille est accessible

expéri-mentalement avec les différentes techniques d’analyses granulométriques.

En voie sèche et avec une plage de tailles de quelques centaines de micromètres à

quelques millimètres, le tamisage peut être utilisé pour caractériser la granulométrie

I.6. Outils de caractérisation

du substrat initial (Del Rio et al., 2012). Néanmoins cette technique nécessite de

grandes quantités de substrat et n’est donc pas adéquate pour un suivi continu dans

le cas de l’hydrolyse. De plus, elle est limitée à des tailles relativement grandes (>100µm).

Une technique de plus en plus répandue est la granulométrie laser dont le principe est

basé sur la diffraction de la lumière incidente à l’encontre d’une particule en suspension

(Figure I.7). L’intensité et l’angle de diffraction sont fonction de la taille des particules,

de leur indice de réfraction et de la concentration du milieu. Le fondement théorique est

donné par la théorie de Fraunhofer complétée par la théorie de Mie. L’intervalle de

dé-tection varie entre quelques dizaines de nanomètres à quelques centaines de micromètres

avec l’hypothèse de la sphéricité des particules et le résultat brut est donné en fractions

volumiques de diamètres équivalents. Cette technique est largement utilisée pour sa

sim-plicité et sa rapidité mais ne donne aucune information sur la forme des particules ni leur

concentration (Silva et al., 2012; Khullar et al., 2013).

FigureI.7 –Schéma illustratif de la diffraction laser (lumières bleue et rouge) à l’encontre

de particules en suspension

1

Pour avoir une idée sur la forme des particules et suivre l’évolution de leurs propriétés

morphologiques durant l’hydrolyse, des techniques de visualisation couplées avec un

trai-tement d’images approprié sont de plus en plus utilisées. Ces techniques sont développées

à la fois en voie sèche et en voie liquide suivant différents dispositifs expérimentaux selon

le besoin (Chinga-Carrasco et al., 2010; Nguyen et al., 2013; Kinnarinen & Häkkinen,

2014).

I.6.2.3 Cristallinité

Pour caractériser la microstructure d’un substrat solide, la technique de diffraction

des rayons X (WAXS : Wide-Angle X-ray Scattering) est la plus utilisée. L’exploitation

du spectre de diffraction pour remonter à l’indice de cristallinité du substrat analysé peut

se faire moyennant différentes méthodes analytiques (Bansal et al., 2010). Segal et al.

proposent la corrélation (équation I.5) pour estimer la fraction cristalline (CrI) à partir

de la hauteur de deux pics (relatifs aux fractions cristalline et amorphe) par rapport à

une ligne de base (Segal et al., 1959).

CrI(%) = ^I

⁰⁰²

−I

_am

I

₀₀₂

·100 (I.5)

I

₀₀₂

est le maximum d’intensité du pic pour 2θ = 22˚(fraction cristalline) et I

_am

le

minimum d’intensité du pic pour2θ= 18˚(fraction amorphe) comme illustré sur la Figure

I.3 (Park et al., 2010).

Figure I.8 –Spectre de diffraction aux rayons X d’une cellulose microcristalline (Avicel

PH-101) illustrant la méthode d’évaluation du taux de cristallinité par la hauteur des pics

(Park et al., 2010)

La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (

13

C-RMN) en phase solide

en utilisant les techniques de l’angle magique (MAS : Magic Angle Spinning) et de la

polarisation croisée (CP : Cross-Polarization) est aussi largement utilisée (Hult et al.,

2000; Park et al., 2009). Cette technique permet l’étude de la nature des liaisons

I.6. Outils de caractérisation

(Berlioz, 2007). Elle donne des résultats précis mais nécessite des temps d’acquisition

longs pour avoir une bonne résolution et perd sa précision pour des substrats à faible

taux de cristallinité (Bansalet al., 2010).

Figure I.9 – Spectres FTIR d’une cellulose microcristalline (Avicel PH-101) avant et

après prétraitement (Ciolacu et al., 2011)

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) est aussi utilisée pour

quantifier le taux de cristallinité d’un substrat. Différents pics sont utilisés du fait du

poly-morphisme de la cellulose qui dépend de sa nature et des prétraitements appliqués (

O’Sul-livan, 1997). O’Connor et al. proposent d’utiliser le ratio des pics 1429 cm

⁻¹

/894 cm

⁻¹

(O’Connor et al., 1958). Nelson et O’Connor utilisent le ratio surfacique 1372cm

⁻¹

/2900

cm

⁻¹

qu’ils valident par comparaison avec la méthode de diffraction des rayons X (Nelson

& O’Connor, 1964). Ciolacu et al. ont utilisé ces deux ratios sur différents types de

sub-strats avec et sans prétraitement puis comparé les résultats avec la méthode de diffraction

des rayons X (Ciolacu et al., 2011). Nous donnons à titre d’exemple les spectres FTIR

d’une cellulose microcristalline avant et après prétraitement visant à la rendre amorphe

(Figure I.4).

est aussi de plus en plus utilisée et peut compléter la FTIR dans certain cas (Schenzel

et al., 2005; Adapaet al., 2009).

Nous avons donné ici une analyse très rapide de quelques techniques expérimentales

utilisées pour la caractérisation des substrats à différentes échelles. Ces techniques sont

dans la plupart des cas complémentaires et permettent le suivi de l’évolution des propriétés

du substrat et de sa conversion durant la réaction d’hydrolyse.

Dans le document Modélisation de l’hydrolyse enzymatique de substrats lignocellulosiques par bilan de population (Page 57-63)