Synthèse des résultats obtenus

Une revue de la littérature a permis d’une part d’identifier les attentes des cliniciens auxquelles devrait répondre une méthode de biométrologie des NP. Elle a également permis d’identifier les techniques d’analyse qui pourraient être utilisées dans ce but parmi celles utilisées en nanotoxicologie ou dans le cadre de la recherche liée à la fabrication et l’utilisation des nanoparticules. Le choix de la microscopie électronique à transmission a été guidé par les nombreux avantages qu’elle représente :

- résolution importante adaptée à l’étude de nanoparticules,

- relative disponibilité pour les cliniciens dans les centres hospitalo-universitaires, - obtention de données aussi bien sur les caractéristiques physiques (taille, degré

d’agrégation) que chimiques (composition élémentaire obtenue par analyse EDX). Ces avantages expliquent que cette méthode soit utilisée pour rechercher et caractériser les nanoparticules dans les tissus ou fluides biologiques dans les quelques rapports de cas existant dans la littérature. Cela explique également que ce soit la technique de référence pour les méthodes de biométrologie des particules minérales fibreuses (amiante) ou non fibreuses (silice, particules métalliques…) de taille micronique. En revanche cette méthode n’a pas fait l’objet de réflexion et encore moins de systématisation pour quantifier les particules nanométriques manufacturées ou non intentionnelles.

Concevoir un protocole de préparation et d’analyse en microscopie électronique adapté aux NP a donc été la première étape de ce travail. Les nombreux tests réalisés ont permis d’obtenir notamment les améliorations suivantes :

Conclusions et perspectives

165 - pour la préparation des échantillons:

o gain de temps (réduction du temps de filtration d’environ un tiers),

o standardisation de la méthode (volume de réactifs utilisé constant permettant de contrôler les sources de contamination donc le bruit de fond),

o adaptation de la technique de préparation à d’autres types d’échantillons que le parenchyme pulmonaire et le liquide de lavage broncho-alvéolaire,

o amélioration de la qualité des grilles pour les rendre compatibles avec un travail à fort grossissement.

- pour l’analyse en microscopie électronique :

o réduction du temps de microscopie nécessaire,

o création d’une méthode d’analyse permettant d’obtenir des indicateurs importants pour l’étude quantitative des NP (indicateurs morphologiques, surface développée).

Ces améliorations ont permis la mise au point d’une méthode de biométrologie adaptée au NP dont la faisabilité et l’intérêt ont été étudiés dans le cadre de deux applications.

La première étude a permis de confimer les résultats des études expérimentales chez l’animal et des études de perfusion de placentas humains ex-vivo tendant à démontrer que des particules exogènes présentes dans la circulation sanguine maternelle étaient capables de traverser le placenta et de s’accumuler dans les tissus fœtaux. Notre méthode permettant d’obtenir des données quantitatives (concentration numérique ou surface développée), nous a permis pour la première fois de démontrer une corrélation entre rétention pulmonaire fœtale et données d’exposition maternelle (exposition aux particules de la fumée de tabac).

La deuxième étude s’est intéressée à la translocation régionale thoracique des particules fines et ultrafines. Elle a permis de démontrer chez l’homme que les particules fines et ultrafines non fibreuses peuvent se concentrer dans la plèvre pariétale comme cela était suspecté à partir de travaux antérieurs sur l’animal (particules nanométriques et fibres) ou chez l’homme (fibres). Nous avons démontré que ces particules se concentrent préférentiellement dans les « black spots » à des concentrations similaires ou supérieures aux concentrations pulmonaires. L’analyse en EDX des particules a permis de retrouver des similitudes en termes de

Conclusions et perspectives

166 composition chimique entre les particules pleurales et pulmonaires, ce qui, compte tenu des données actuelles de la littérature sur la physiologie pleurale et la clairance lymphatique pleurale et pulmonaire, suggère une translocation régionale via l’espace pleural. Contrairement à la première étude sur les échantillons foetaux dans laquelle la majorité des particules était des agrégats de PUF métalliques, les particules retrouvées dans le poumon et la plèvre étaient principalement des particules ultrafines de carbone issues de la combustion. Dans le cadre de ces deux études, nous nous sommes heurtés à des questions liées à l’interprétation des observations réalisées en microscopie électronique. Ces questions ont fait l’objet de discussions lors de réunions d’un groupe de travail réunissant des chercheurs ou des techniciens spécialisés dans la caractérisation de particules de tailles nanométriques dans l’air ou les tissus humains et étaient principalement de deux ordres :

- Quel est le degré de variabilité inter opérateur sur ce type de méthode et les possibilités d’y remédier ?

- Est-il possible de relier les particules observées dans les échantillons à des sources d’exposition environnementales et professionnelles?

Les tests réalisés ont montré une variabilité non négligeable sur le classement des particules en fonction de leur aspect ou de leur composition chimique. Afin de répondre à cette préoccupation, les critères de classement ont été revus et simplifiés par consensus et un portfolio des particules observées et leurs spectres EDX a été créé afin de servir de support aux futures observations en MET.

Afin de répondre à la deuxième question, une veille active de la littérature a été effectuée afin de recueillir des données sur l’analyse de PUF dans l’air en microscopie électronique à transmission et en spectrométrie EDX. Ces données étant relativement peu nombreuses notamment pour le tabac, il nous a semblé interessant de compléter les analyses d’échantillons biologiques par une étude des émissions de particules ultrafines par un procédé de travail potentiellement émissif et une étude des particules contenues dans la fumée de tabac.

L’étude de l’exposition des travailleurs aux particules fines et ultrafines dans le cadre de chantiers de meulage de rail a permis de démontrer que les expositions principales des

Conclusions et perspectives

167 travailleurs étaient liées aux particules ultrafines émises par les moteurs diesel et non à des particules métalliques émises lors du meulage comme cela était suspecté. Elle a permis d’améliorer les connaissances sur l’aspect et la composition chimique des particules ultrafines émises par des moteurs diesel et de retrouver des similitudes avec les particules ultrafines de carbone déja retrouvées dans les échantillons biologiques.

L’étude préliminaire des émissions de particules lors de la combustion de tabac n’a pas permis de retrouver des caractéristiques physicochimiques permettant de différencier en microscopie électronique ces particules carbonées de celles issues d’autres sources de combustion.