PREPARATION DES ECHANTILLONS :

- Travailler sous hotte à flux laminaire en position travail - Déposer le prélèvement sur une grande lame

- Couper 2 morceaux de parenchyme 1 et 2 - Les égoutter à l’aide de papier absorbant

- Les peser sur la balance pour obtenir PH1 et PH2 (PH= Poids Humide) - Noter les poids sur le registre noir Biologie-MET

- Filtrer l’hypochlorite de sodium nécessaire à la digestion avec une seringue + MILLEX - Mettre le morceau n 1 dans un bécher avec un barreau aimanté, y verser de l’hypochlorite de Sodium

- Mettre sous agitation magnétique - Laisser digérer environ 1 h

- Mettre à sécher le morceau n 2 à l’étuve à environ 60° pendant au moins 24 h - Le peser pour obtenir le PS2 (PS = Poids Sec)

- Noter le poids sur le registre noir Biologie-MET - Un témoin analyse est préparé simultanément Filtration :

- Mesurer le volume du digestat à l’éprouvette au cas où la totalité ne pourrait pas être filtrée -Selon l’aspect trouble ou opaque du digestat, utiliser un système de filtration de 25 mm ou de 47 mm de diamètre

-Mettre quelques ml d’alcool isopropylique sur la base de filtration, déposer à l’aide d’une pince Millipore le filtre Nuclépore prémétallisé au carbone (face brillante carbonée sur le dessus).

- Adapter l’entonnoir de filtration au dessus et serrer l’ensemble avec la pince adaptée

-Vérifier l’étanchéité du système en versant dans l’entonnoir quelques ml d’eau déminéralisée puis allumer la pompe pour faire passer l’eau.

- Filtrer le digestat dans l’entonnoir * et le rincer avec de l’eau déminéralisée - Rincer le bécher, l’éprouvette avec de l’eau déminéralisée

- Verser cette eau de rinçage dans l’entonnoir et y rajouter de l’eau déminéralisée si nécessaire - Prélever le filtre avec une pince Millipore, le déposer dans un pétrislide, préalablement étiqueté et faire sécher le filtre environ 5 minutes à l’étuve couvercle entrouvert.

192 MODE OPERATOIRE : IDENTIFICATION ET COMPTAGE DES PARTICULES DANS LE

PARENCHYME PULMONAIRE EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE

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METALLISATION :

- Une fois sec, le filtre est métallisé dans l’évaporateur TRANSFERT :

- Faire le transfert, sous la hotte, sur des grilles de cuivre de 200 mesh provenant d’un lot dont la surface moyenne d’ouverture de grille a été mesurée (coefficient de variation

< 5 %) selon la norme NF X 43-050

- Transférer au moins 2 grilles et les ranger dans la boite de grilles en cours. - Ranger le pétrislide (stockage)

*a) Si mauvaise filtration du digestat (temps trop long) : - Rincer à l’eau déminéralisée.

- Brûler le Nuclépore dans le four à plasma

- Refiltrer les cendres sur un Nuclépore comme précédemment (1). *b) Si arrêt total de la filtration sur le Nuclépore :

- Arrêter la filtration.

- Mesurer le volume du digestat restant dans l’éprouvette.

- Le filtrer sur une membrane Millipore comme précédemment (1). - Brûler dans un bécher dans le four à plasma.

- Reprendre les cendres dans de l’eau déminéralisée et refiltrer sur une membrane Nuclépore de 25 mm de diamètre.

*c) Si l’aspect du digestat est trouble ou opaque :

- Filtrer directement sur Millipore.

- Brûler dans un bécher dans le four à plasma ;

- Reprendre les cendres dans de l’eau déminéralisée et refiltrer sur une membrane Nuclépore de 25 mm de diamètre ;

OBSERVATION :

Au microscope électronique à transmission analytique équipé d’un analyseur en dispersion d’énergie des rayons X

- Réglage du META selon la notice N4T3 - Observation à faible grossissement :

. Elimination de la grille si : - dissolution incomplète

- plus du quart des ouvertures déchirées

. Si les grilles sont illisibles (trop chargées en particules ou agglomérats) :

S’il reste du parenchyme pulmonaire on reprépare une quantité moindre sur une membrane Millipore qui sera brûlée puis refiltrée sur Nuclépore

193 MODE OPERATOIRE : IDENTIFICATION ET COMPTAGE DES PARTICULES DANS LE

PARENCHYME PULMONAIRE EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE

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COMPTAGE :

- Remplir la fiche d’analyse E129S1PB

- Calculer le nombre d’ouvertures de grilles (nc) à examiner en fonction de la sensibilité d’analyse souhaitée (Sa : 1,5 x 105

particules/g), lire au minimum 4 carreaux.

- Compter le nombre de particules sur le nombre d’ouverture calculé. Si le résultat final est < 108 particules/g on ne fait pas l’identification.

- Si le résultat final est  108 particules/g, on fait l’identification de 50 particules : observer au moins 2 grilles à un grossissement de 25 000. Chaque particule observée sur des champs au hasard est analysée et mesurée et son spectre est enregistré, le formulaire E129S1PB est rempli et le pourcentage des particules est calculé.

- En cas de nombreuses particules (en moyenne plus de 25 particules par carreaux), compter 200 particules sur au minimum 4 ouvertures de grille.

- Si les particules sont très nombreuses, faire un comptage par champs au hasard sur 30 champs à un grossissement approprié (15 000 à 25 000).

- Le témoin analyse n’est lu (compter les particules sur 10 carreaux) que si la charge particulaire est  108 particules/g. Le témoin analyse ne doit pas avoir plus de 10 particules par carreau, dans ce cas, rechercher la cause de la présence des particules.

- Calculer la concentration numérique C = N x Sa

C = concentration en nombre de particules par g arrondi à 2 chiffres après la virgule en 107 N = nombre total de particules comptées

Sa = sensibilité d’analyse calculée = 1 x S/s x PS1 x nc

(PS1 : Poids sec - S : surface de filtration** – s : surface moyenne d’une ouverture de grille) La référence utilisée provient de la série de sujets témoins non exposée professionnellement dont la concentration est : 9  8 x 107 p/g de tissu sec [1 x107 p/g – 17 x 107 p/g]

BLANCS :

Une membrane de chaque boite de 100 est préparée et lue. Les résultats sont notés sur les formulaires E62G2 pour les membranes en ester de cellulose et le formulaire E61G2 pour les membranes en polycarbonate.

Un témoin eau déminéralisée est préparé chaque mois en filtrant 100 ml d’eau sur un filtre Nuclépore. Lire 10 carreaux au META et enregistrer les résultats sur le formulaire E88G2.

194 STOCKAGE :

S’il reste du parenchyme pulmonaire, rajouter du formol dépoussiéré dans le flacon et stocker l’échantillon restant pendant un minimum de 5 ans.

**Surface de filtration : Mesurer la surface de filtration tous les ans Préparer une suspension d'alcool isopropylique et de poudre de carbone Mesurer le diamètre de filtration avec le pied à coulisse I102

Calculer le diamètre moyen, l’écart type et la surface de filtration Compléter le formulaire E80S1PP

195 2. Annexe 2 : Extrait du portfolio Nanotrans