Les résultats concernant le chapitre 3 sont introduits en deux parties: Une première partie avec un article soumis (article 3
Nox4 recombinant à partir de 2 approches expérimentales: une expression dans E. Coli et une expression à
in vitro (RTS, rapid translation system).
Ces deux approches méthodologiques sont comparées au plan quantitatif et en ce qui concerne le rendement et rase des formes recombinantes synthétisées est évaluée.
Une deuxième partie avec un article qui est actuellement en préparation (article 4) et qui
partenariat avec ox. Il consiste à
appliquer une nouvelle approche expérimentale: «Topological Determination by Ubiquitine Fusion Assay, TDUFA».
The study of constitutive diaphorase activity of Nox4 (article 3) Résumé en français
1 Introduction
Le mécanisme de transfert d'électrons est bien documenté pour la protéine Nox2. L'activité diaphorase correspond à un transfert d'électron depuis NADPH jusqu'au centre redox du FAD (portion en C terminale de Nox2). Cette activité peut être distinguée de l'activité NADPH oxydase par utilisation d'un accepteur d'électron directement à partir du FAD, l'INT (Iodonitrotetrazolium); cette activité est mesurée soit à partir de la protéine entière soit sur la protéine tronquée ne contenant que la partie cytosolique. La protéine Nox4 n'a encore jamais pu être isolée sous forme native probablement compte tenu des très faibles quantités de protéine Peu de données existent à l'heure actuelle, concernant les sites impliqués dans l'activité diaphorase de Nox4. Une étude récente a indiqué que l'activité constitutive de Nox4 réside dans le domaine catalytique, flavodeshydrogénase, qui contient un site de liaison du NADPH et un autre pour le FAD.
2 Expression de différentes constructions de Nox4 recombinant par RTS Résultats:
- La présence de groupements de codons rares (1363AGA AGA CUA1371) de Nox4 affectent la synthèse des
protéines Nox4 par RTS et e le niveau de
production protéique.
- -2TM-CH, Nox4-1TM-CH, Nox4Aqc-CH et
Nox4Bqc-CH sont optimisées en présence de 0.1mM de DDM, de la protéine chaperonne GroE et 0.1mM/4mM de GSH/GSSG par RTS.
3 Expression de Nox4 recombinant dans les bactéries Résultats:
- La production de ces protéines par les bactéries BL21( DE3) aboutit à l'apparition de formes tronquées. L'apparition des protéines est également la conséquence de la présence de groupements de codons rares (1363AGA AGA CUA1371) de Nox4. Là encore on a utilisé la souche d'expression bactérienne BL21( DE3) CodonPlus RIL.
- e la protein NH-Nox4Aqc est optimisée en présence de 50mM de Tris-HCl pH 7,6, 500mM de NaCl, 1% de Chaps, 10mM de DTT, 2 g/ml de pepstatin, 2 g/ml de leupetin et 10 M de TLCK par les bactéries.
4 Activité diaphorase Résultats:
- Pour les deux protéines Nox4Aqc-CH et NH-Nox4Aqc, le cytochrome c, accep présente une ac INT. En plus la protéine Aqc produit en système bactérien possède une activité spécifique plus faible comparée à la protéine synthétisée en milieu acellulaire.
- L
Summary in English 1 Background
The mechanism of electron transfer is well documented for the Nox2 protein. Diaphorase activity is the electron transfer from FAD to redox center and is located at the cytosolic tail of Nox2. This activity can be distinguished from the NADPH oxidase activity by using INT (iodonitrotetrazolium) as a direct FAD electron acceptor, in PLB985 cells expressing the whole protein (Pessach et al., 2001) and truncated protein containing only cytosolic part (Pessach et al., 2006). Experiments with Nox2 truncated forms produced by bacteria were able to determine the region responsible for this activity, which corresponds to amino acids 221 to 570. The diaphorase activity is intrinsic and does not require the presence of cytosolic factors.
Few data exist at present on the diaphorase activity of Nox4. Nox4 protein has not been isolated probably due to the very low amounts of expression and also because its subcellular localization is not well defined. In order to characterize the molecular mechanism involved in the establishment of the electron transfer through Nox4, a series of truncated Nox4 proteins containing the NADPH and FAD domain were generated by two methods (in vitro RTS and bacteria induction) to study its diaphorase activity.
2 In vitro expression of Nox4 truncated proteins by RTS
4 truncated Nox4 proteins (2-TM, 1-TM, Aqc, Bqc) were synthesized in vitro by RTS system. Each protein contains a poly-histidine tag either at the C terminus or at the N terminus. The protein expression was analyzed by western blot using an anti-histidine antibody. As different predictive softwares reveals a high hydrophobic domain surrounding the first NADPH binding site, the solubility of these proteins were optimized under different conditions to facilitate the correct folding of the proteins during its synthesis.
The presence of rare codons (1363
AGA AGA CUA1371) affects the synthesis of Nox4 by RTS and the position of the poly-histidine tag influences the expression level of 2-TM and 1-TM, therefore, C terminal tagged proteins was chosen to use in RTS study;
The solubility of these proteins are optimized in the presence of 0.1mM DDM, GroE and 0.1mM/4mM of GSH/GSSG.
3 Expression of Nox4 truncated proteins by bacterial induction
Constructs were transformed into BL21( DE3) CodonPlus RIL bacteria and the expression of the proteins was induced by the addition of IPTG. The expression of these proteins was analyzed by western blot.
Then an extensive screening of refolding conditions was performed to obtain soluble proteins.
As rare codons (1363AGA AGA CUA1371) also affects the synthesis of Nox4 by bacterial induction, BL21( DE3) CodonPlus RIL bacteria strain was used. NH-Nox4-2TM was unable to be synthesized;
The solubility of these proteins are optimized in lysis buffer containing the detergent chaps (50mM Tris pH7.6, 500mM NaCl, 10mM DTT, 1% Chaps, 2 g/ml pepstatin, 2 g/ml leupetin et 10 TLCK).
4 Diaphorase activity of recombinant truncated Nox4 truncated constructions
Large scale of truncated Nox4Aqc and Nox4Bqc were produced using optimized conditions for the RTS system and bacterial induction approach. Then soluble proteins were purified onto chromatography and were tested for the diaphorase activity (INT and cytochrome c).
For both proteins Nox4Aqc-CH and NH Nox4Aqc, electronic acceptor cytochrome c gives a higher rate than INT. And Nox4Aqc produced a lower specific activity by a cell-based system compared to the protein synthesized in cell-free technology;
The diaphorase activity of Nox4 is not stimulated by the addition of cytosolic factors.
My contribution to this work includes over-expression the truncated Aqc proteins in large scale by bacterial induction approach, optimization of the recombinant proteins and purification; study the diaphorase activity of NH-Nox4Aqc (INT and cytochrome c).
Article 3:
Nox4 cytosolic domain generates a constitutive diaphorase activity. Chuong Nguyen, Leilei Zhang, Nicolas