Le processus de la différenciation cellulaire implique la trans cription efficace et sélective des différentes régions du génome. Actuelle ment, il est clair qu'une cellule donnée réprime l'expression de la plus grande partie de son DNA et en même temps active la transcription d'un petit nombre de gènes nécessaires pour accomplir la fonction qui la ca ractérise (ALLFREY et MIRSKY, 1 963 ; Mc CAR TH Y et HOYER, 1 964 ; PAUL et GILMOUR, 1 966). Les approches expérimentales qui essayent d'établir, pour la chromatine, des rapports structure-fonction en termes moléculaires précis, ont été développées sur la base de l'existence et des propriétés du nucléosome.
Bien que dans le concept actuel le nucléosome soit encore une structure statique, des composants dynamiques pourraient y être présents (WEINTRAUB et al, 1976 ; OUDET et al, 1977). L'activation d'une région - particulière du génome cellulaire pourrait dépendre de la plasticité du
nucléosome. Cette vue d'une chromatine structurée, mais avec des possi bilités de changements dans des régions particulières, est en opposition avec le rôle de répresseurs non spécifiques de la transcription, que l'on attribuait aux histones (STEDMAN et STEDMAN, 1951; HUANG et BONNER,
1 962
).
Des efforts considérables ont été faits ces quatre dernières années pour répondre à la question : les nucléosomes sont-ils présents dans les régions du génome qui sont transcriptionnellement actives ? La réponse non équivoque comporte nécessairement l'isolement à partir de la chroma tine d'un gène activement transcrit à’un moment donné, et la caractérisa tion des éléments qui le composent.
Au point de vue opérationnel, on peut résumer cette question en trois points :
1. La chromatine active dans la transcription est-elle organisée en unités répétitives ?
2. Les histones sont-elles responsables de cette organisation de la chromatine active ?
3. Existe-t-il des différences entre les unités répétitives de la chromatine active et les nucléosomes ?
Deux voies d'approche ont été utilisées pour essayer de donner une réponse à ces questions. De nombreuses méthodes ont été développées pour la purification des fractions de chromatine enrichies en complexes de transcription (GOTTESFELD, 1 977 a). L'emploi de sondes spécifiques (DNA complémentaires a\ix RNA ribosomiques, au mRNA de l'hémoglobine et au mRNA de l'ovalbumine) ont permis d'explorer la présence de séquences précises à l'intérieur des nucléosomes (CHAMBON, 1 977). Des renseigne ments complémentaires ont été aussi obtenus par microscopie électronique (SCHEER, 1 978).
2.1. PURIFICATION DE LA CHROMATINE ACTIVE DANS LA TRANSCRIPTION
Le fractionnement de la chromatine en chromatine active dans la transcription et en chromatine inactive comporte le plus souvent des opé rations mécaniques qui produisent des dommages considérables à la struc ture native de la chromatine étudiée (NOLL et al, 1975 ; DOENECKE et McCarthy, 1976 ; de la MAZA et ai, 1 976 ; TASHIRO et KUROKAWA, 1 976). MARUSHIGE et DONNER ont décrit une méthode de fractionnement douce qui implique l'action de la DNAase II (MARUSHIGE et BONNER, 1971). Le schéma de fractionnement comporte deux étapes (voir schéma 2). La DNAase II coupe préférentiellement les régions actives dans la transcrip tion ; puis la chromatine inactive solubilisée peut être précipitée à l'aide
+2 d'ions divalents, en particulier les ions Mg
Schéma 2 (MARUSHIGE et BONNER, 1971)
(370 fx<i/rry\ DNA, 25 mM No Acetcte, pH 6.6) DNose H
(100 units/mO Incubote 5 mm ût 2A* Centrifuge (27,000q, 15 min ) f Pellet 84.6 î 4.8% of DNA Supernotant
©
|2mM MqClg Centrifuge (27.000g, 15 min)r
Pellet 4.1 î 2.5% Supernotont0
11.31 S.O"'.'Un certain nombre d'indications expérimentales suggèrent que les fra^ctions (S 2 dans le schéma) qui sont sensibles à l'action de la
+2
DNAase II et solubles en présence de Mg correspondent aux régions qui sont transcrites "in vivo".
A) La quantité de DNA récupérée dans ces fractions est variable, mais en étroit rapport avec l'activité transcriptionnelle du type cellulaire étudié (BILLING et BONNER, 1 972).
b) Les séquences du DNA ainsi solubilisées sont hautement spé cifiques. Différentes populations cellulaires contiennent différentes sé quences de DNA dans les fractions solubilisées (GOTTESFELD et al, 1976).
C) Des chaînes de RNA récemment démarrées, ainsi que l'activité +2
RNA polymérasique sont copurifiées avec la fraction Mg -soluble (MARUSHIGE et BONNER, 1 971 ; BONNER et al, 1 973 ; KIMMER et al, 1 976).
D) Un enrichissement en séquences codant pour les chaînes de
+2
globine a été trouvé dans les fractions Mg solubles provenant des réticu locytes. On ne trouve pas d'enrichissement comparable lorsque l'on part de cellules de foie (DON HENDRICK et al, 1 977).
E) Les cellules leucémiques de Friend peuvent être induites à synthétiser de l'hémoglobine en présence de dyméthyl sulfoxide (DMSO).
+2
Les fractions Mg -soluble des cellules autant induites que non induites possèdent le même enrichissement en séquences codant pour l'hémoglobine (WALLACE et al, 1 977 ; LAN et al, 1 978) ; néanmoins, si l'on prépare la
+2
fraction Mg -soluble en partant d'un clone qui a perdu la capacité à être induit avec le DMSO, on obtient un enrichissement en séquences codant pour l'hémoglobine nettement inférieur (WALLACE et al, 1 977 a).
Les propriétés physiques et la composition.de cette fraction solu bilisée à l'aide de la DNAase II ont été étudiées par rapport à la chromatine inactive (COTTESFELD étal, 1 975 ; GOTTESFELD et BUTLER, 1 977). Le
+2
DNA de la fraction Mg -soluble présente sur gel d'agarose un comporte ment électrophorétique identique à celui d'un DNA provenant d'une digestion avec la nucléase de micrococcus. Le nombre de paires de bases de l'unité répétitive dans les deux cas est identique ; néanmoins, une différence est claire : le monomère de la chromatine enrichie en complexes de transcrip tion sédimente aux environs de 14 S, tandis que celui de la chromatine digé rée à l'aide de la nucléase de micrococcus sédimente à 11 S.
Lorsque l'on digère avec la nucléase de micrococcus des noyaux de cellules HeLa préalablement marquées "in vivo" avec de l'Uridine tritiée, et que l'on analyse le matériel résultant sur un gradient isocinétique, on trouve que les pics de densité optique et ceux de radioactivité sont nettement déplacés l'un par rapport à l'autre (voir figure 8).
Figure 8 (GOTTESFELD et BUTLER, 1 977)
Sucrose gradient sedioentation of a nlcrococcal nuclease digesc of idine-Labelled HeLa nuclei. HeLa celle vcre labelled and nuclei were isolaced as describcd. Nuclei t/ere treaced with nlcrococcal nuclease (200 unics/nl for 4 nin ac 37^) and che réaction vas stopped by che addition of LDTA (pH d) to 25 nM, Chroinacin vas centrifuged in a 5 - (v/v) iso-kinetic sucrose gradient at 35,000 rpn for 14.75 h. Aliquots of each fraction vere precipitated vith cold lOZ trichloroacetic acid. Insoluble naterial vas collected on CF/C filtcrs and counced in Liquifluor. ^—) üptical densicy profile; (-o-) trichloroacetic acid - insoluble radio- activitv.
Quand on isole du gradient décrit ci-dessus de la région 14 S et que
^ +2
l'on la resédimente en présence de Mg , entre 50 - 70 % de la radioactivité sédimente à nouveau dans la position 14 S, tandis que seulement entre 5-10 % du DNA mis sur le gradient reste à cet endroit. Cette expérience suggère très fortement que le monomère 14 S obtenu d'un fractionnement à l'aide de
+2
la DNAase II et le Mg , contient des chaînes de RNA récemment initiées. Si la sous-unité 14 S est traitée avec de la RNAase et est ensuite resédimen-tée, on observe une diminution du coefficient de sédimentation à 11 S. De
^ +2
plus, la particule résultante est insoluble en présence de Mg
Le monomère 11 S et la sous-unité 14 S présentent un comportement similaire vis-à-vis de la DNAase I. Dans les deux cas, une série caractéris tique de bandes de DNA de longueurs multiples de 1 0 nucléotides est observée en gels de polyacrylamide dénaturants. Cependant, la vitesse de digestion par la DNAase I est beaucoup plus grande dans le cas de la sous-unité 14 S. Si dans la technique de préparation de chromatine active de MARUSHIGE et BONNER, on remplace la DNAase II par la DNAase I dans l'étape de
diges-+2
tion des noyaux, aucun matériel n'est récupéré dans la fraction Mg -soluble (GOTTESFELD et BUTLER, 1 977). Il est important de signaler que la
DNAase I et la DNAase II agissent d'une manière différente. Bien qu'ayant également une action élective sur les régions transcrites, la DNAase I y digère de façon beaucoup plus poussée, (voir plus loin).
La composition en protéines et en RNA de la chromatine non frac tionnée, du monomère obtenu à l'aide de la nucléase de micrococcus et du monomère provenant d'une chromatine enrichie en complexes de transcrip tion est donnée dans la table 3.
Table 3 (GOTTESFELD et BUTLER, 1 977)
,
Chemical composition
i
o£ chronatin subunits
Composition relative to DNA (w/w) DNA Histone Nonhistone RNA
protein protein
Unfractionated chronatin 1.00 1.06 0.65 0.05 iIlS nucléosomes 1.00 1.03 < 0.05 <0.05 t1 14S Mg^-soluble subunits 1.00 0.97 1.35 0.3-0.4
On peut conclure de ces études que les régions riches en complexes
+2
de transcription, solubilisées à l'aide de la DNAase II et du Mg , ont une composition normale en histones, sont très riches en protéines non histones et en RNA et possèdent une structure "nucléosome like" qui ressemble for tement à la structure de la chromatine inactive.
La coupure préférentielle des régions actives en transcription n'est pas une propriété exclusive de la DNAase II. Tout récemment, TATA et BAKER (TATA et BAKER, 1978) ont montré que des digestions extrêmement douces avec la nucléase de micrococcus conduisent à la solubilisation d'une fraction de chromatine qui contient aux environs de 85 % de l'activité RNA polymérasique B. Cette fraction comporte 10 % de la totalité du DNA nu cléaire sous la forme de polynucléosomes. La taille des fragments de chro matine ainsi obtenue oscille entre 200 et 6000 paires de bases (entre 1 et 30 nucléosomes). En employant une approche similaire, BLOOM et ANDERSON ont réussi à obtenir des fractions de chromatine d'oviducte enrichies entre 5 et 6 fois en séquences codant pour l'ovalbumine (BLOOM et ANDERSON, 1 978).
2.2. PROPRIETES DE LA CHROMATINE ACTIVE DANS LA TRANSCRIPTION La principale approche employée pour l'élucidation des propriétés de la chromatine active en transcription a été l'hybridation avec des sondes spécifiques, des fragments de DNA produits à partir de chromatine à l'aide des nucléases. On peut suivre de cette manière les propriétés des frag ments du génome qui hybrident avec ces sondes (généralement des RNA ribosomiques, des DNA complémentaires aux m-RNA de l'hémoglobine ou de l'ovalbumine et des DNA de yirus qui peuvent s'intégrer dans le génome cellulaire) et comparer, dans un tissu donné, des régions exprimées du génome et celles ne s'exprimant pas.
2. 2. 1. Action de la DNAase I : la chromatine active dans la transcription a une conformation altérée vis-à-vis de la chromatine inerte.
Les premières preuves que la chromatine active dans la transcrip tion est organisée d'une manière différente de la chromatine inerte dérivent des expériences de digestion du DNA nucléaire avec la DNAase I
(WEINTRAUB et GROUDINE, 1 976 ; GAREL et AXEL, 1 976 ; MATHIS et GOROVSKY, 1977). Ces auteurs ont démontré qu'aussi bien dans le cas des gènes ribosomiques que dans le cas de gènes non-ribosomiques la chroma tine active en transcription est dégradée plus rapidement en fragments non hybridables que la chromatine inerte. Ainsi, lorsque l'on isole des noyaux de réticulocytes et qu'on les digère à l'aide de la DNAase I, la vitesse de disparition des séquences codant pour la globine est cinq fois supérieure à celle des séquences codant pour l'ovalbumine (WEINTRAUB et GROUDINE,
1976) . Lorsque l'on fait des expériences parallèles sur des noyaux d'ovi- ducte de poule, ce sont les séquences codant pour l'ovalbumine qui se dé gradent préférentiellement (GAREL et AXEL, 1 976). Des gènes qui sont transcrits dans l'oviducte à des vitesses très différentes, présentent des vitessesde digestion, vis-à-vis de la DNAase I, comparables (GAREL et al,
1977) . Ce dernier résultat suggère que la présence d'un gène très actif dans la transcription n'est pas une condition nécessaire pour augmenter sa susceptibilité vis-à-vis de la DNAase I. Le fait que la sensibilité vis-à-vis de la DNAase I des gènes codant pour la globine est maintenue dans les érythrocytes où toute activité transcriptionnelle a cessé (WEINTRAUB et GROUDINE, 1976), suggère, comme les résultats de GAREL et collabora teurs, que la digestion préférentielle par la DNAase I de certaines régions du génome n'est pas une conséquence directe du processus de transcription A l'heure actuelle, le fait que la DNAase I digère préférentiellement des
séquences en train de s'exprimer a été confirmé dans de nombreux systèmes quelques séquences qui s'expriment sélectivement chez Drosophila
(BIESSMANT et al, 1 977) ; les séquences codant pour la globine dans les "mouse erythroleukemia cells", avant ou après la maturation induite par le diméthylsulfoxide (MILLER et al, 1 978) ; des fragments de séquences virales s'exprimant dans des cellules transformées par l'adénovirus type 5 (FLINT et al, 1 977) ; chromatine virale intégrée dans les cellules trans formées par le virus SV40 (CHI-BOM CHAE et al, 1 978).
2. 2. 2. Action de la nucléase de micrococcus : les régions du génome qui sont actives dans la transcription contiennent une unité répétitive.
LACY et AXEL (LACY et AXEL, 1 975) ont montré que la plupart des séquences du génome étaient présentes dans le DNA extrait du mono mère qui a été produit par digestion avec la nucléase de micrococcus. En outre, les cinétiques de réassociation entre le cDNA (DNA complémen taire obtenu à l’aide de la transcriptase inverse) des mRNA polysomiques
et le DNA extrait du monomère sont identiques à celles obtenues entre ce cDNA et le DNA total. Les séquences complémentaires à un cDNA parti culier, le cDNA et la globine, sont également à la même concentration dans le DNA total des réticulocytes et dans le DNA extrait du monomère.
En admettant que l'on travaille avec des populations de cellules homogènes qui expriment toutes en même temps un gène donné, les résul tats de LACY et AXEL suggèrent que les régions du génome qui sont ac tives en transcription contiennent l'unité répétitive qui caractérise la
chromatine inactive. Etant donné que l'on ne trouve pas dans le DNA extrait du monomère un enrichissement en séquences codant pour un gène qui s'exprime dans les cellules étudiées, ces auteurs ont conclu que la nucléase de micrococcus était incapable de distinguer entre les régions du génome qui sont en train de s'exprimer et celles qui sont inactives. La non-spécificité de cette nucléase vis-à-vis des séquences codant pour la globine, pour l'ovalbumine et pour des gènes ribosomiques a été aussi proposée par d'autres auteurs (GAREL et AXEL, 1 976 ; WEINTRAUB et GROUDINE, 1 976 ; REEVES et JONES, 1 976).
Il y a deux façons biochimiques de mettre en évidence les diffé rents multimères obtenus à l'aide de la nucléase de micrococcus. On peut soit séparer les différents polynucléosomes à l'aide par exemple d'un gradient isocinétique (voir figure 8), soit en déprotéinisant le matériel mettre en évidence le contenu en DNA des différents multimères à l'aide d'un gel d'agarose (voir figure 2). Dans le cas de la chromatine active, on obtient un rapport identique entre monomères, dimères, etc. .. du
matériel venant du gradient isocinétique et monomères, dimères, etc. . . , de DNA provenant de gel d'agarose. Dans le cas de la chromatine active, on ne peut parler d'unité répétitive que si, en dosant un gène particulier tout au long des gradients où des gels décrits ci-dessus, on retrouve un monomère, un dimère, etc. . . , qui contienne les séquences du gène. Ces multimères de gènes actifs, si ils existent, ne doivent pas à priori néces sairement coincider avec ceux de la chromatine inactive (voir plus loin). Les travaux décrits ci-dessus (LACY et AXEL, 1 975 ; GAREL et AXEL, I 976) montrent la présence des séquences transcrites non ribosomiques dans les monomères obtenus à l'aide de la nucléase de micrococcus. II est important de souligner que ces monomères proviennent d'un fraction nement à l'aide d'un gradient isocinétique (voir figure 8).
En employant une approche différente (digestion avec la nucléase de micrococcus suivi du fractionnement du DNA résultant sur gel d'agarose), BELLARD et collaborateurs (BELLARD et al, 1 977) ont montré la présence d'une structure répétitive dans le cas d'un gène non ribosomique s'exprimant dans les cellules d'oviducte. Ce travail a démontré que l'unité répétitive codant pour l'ovalbumine et celle de la chromatine inactive contiennent un DNA de taille identique. Ces auteurs ont également trouvé un enrichisse ment en séquences codant pour l'ovalbumine au fur et à mesure que l'on dose les fragments de DNA de masse moléculaire plus petite. Ce dernier résultat démontre que la nucléase de micrococcus est capable de différen cier entre un gène exprimé et un autre qui ne l'est pas. Cette conclusion est en conflit avec celles d'autres auteurs (GAREL et AXEL, 1 977 ;
WEINTRAUB et GROUDINE, 1976). Par contre, JOHNSON et collaborateurs (JOHNSON et al, 1 978) ont montré que les gènes ribosomiques de "Physarum polycephalum" sont reconnus préférentiellement par la nucléase de micro coccus.
Comment peut-on réconcilier les résultats de BELLARD et colla borateurs avec ceux qui suggéraient l'absence d'attaque préférentielle des gènes actifs en transcription ? Le fait que le DNA isolé des différents poly- nucléosomes fractionnés sur gradient isocinétique, n'est pas enrichi en séquences codant pour un gène activement transcrit pourrait s'expliquer par
la différence entre la constante de sédimentation du monomère selon qu'il provienne de chromatine active ou inactive. En effet, les expériences de GOTTESFELD et BUTLER décrites antérieurement (voir page 28) suggèrent fortement que le monomère de la chromatine active pourrait avoir une cons tante de sédimentation de 14 S, tandis que celle du monomère de la chroma tine inactive serait de 11 S.
Des études basées aussi sur l'action de la nucléase de micrococcus ont démontré que les gènes ribosomiques se présentent sous la forme d'une structure périodique comportant une unité répétitive qui contient un DNA de longueur similaire à celui d'une unité répétitive de la chromatine inactive (MATHIS et GOROVSKY, 1 976 ; REEVES, 1976 ; REEVES et JONES, 1 976 ; JOHNSON étal, 1 978 ; GOTTESFELD et MELTON, 1 978).
Etant donné que les histones sont responsables de la structure pé riodique présente dans la chromatine inactive, il est fort possible qu'elles soient aussi à l'origine de la structure répétitive présente dans les régions du génome actives en transcription.
2. 2. 3. Le gène actif en microscopie électronique
La microscopie électronique permet également d'observer des dif férences entre la structure de la chromatine active dans la transcription et celle de la chromatine inactive. La technique d'étalement de chromatine mise au point par MILLER et collaborateurs (MILLER et BEATTY, 1 969) permet de visualiser les processus de transcription (MILLER et BAKKEN, 1 972). A l'aide de cette technique, on peut visualiser deux sortes de populations
comportant des complexes de transcription. Ces deux populations, l'une codant pour les RNA ribosomiques, l'autre pour les RNA non-ribosomiques, diffèrent en ce qui concerne la longueur du DNA transcrit, la proximité re lative entre les unités transcriptionnelles et la morphologie chromatinienne (FOE et al, 1 976).
A l'intérieur des régions codant pour les RNA ribosomiques, faci lement reconnaissables par la structure typique en arbre de Noël, on ne visualise pas de structures nucléosomiques (FOE et al, 1 976 ; McKNIGHT
et al, 1 977 ; FRANKE et al, 1 977 ; WOODCOCK et al, 1 976) puisque le rap port entre la longueur du DNA (forme B) d'un gène de RNA ribosomique et la longueur d'une unité transcriptionnelle est de l'ordre de 1.2 . Néan moins, la fibre chromatinienne ne possède pas non plus les caractéristiques
O
d'un DNA nu. Son épaisseur oscille entre 40 - 70 A (un DNA nu a une
épais-O
seur de 20 A).
Les régions non-ribosomiques sont beaucoup plus difficiles à iden tifier. Lorsque cela a été fait (McKNIGHT et al, 1 977 ; FOE étal, 1976 ;
LAIRD et al, 1 976) des difficultés sérieuses se présentent pour définir l'unité transcriptionnelle et en conséquence il est difficile de déterminer le "packing ratio" (rapport d'empaquetage), nécessaire pour caractériser les nucléosomes La simple observation de ces régions conduisent à la visualisation de struc tures "nucléosome-like" se présentant moins fréquemment que dans les cas de la chromatine inerte. Des expériences avec des anticorps des histones H2b et H 3 ont démontré que ces deux histones sont présentes dans les com plexes de transcription non-ribosomiques (McKNIGHT étal, 1 977) (voir ■ table 4).
Table 4 (FOE et al, 1 976)
Dislinguishing Properlies of Active Ribosomal and Nonribosomal Transcription Units in Embryos ot O. fasciatus
Property Ribosomal Nonribosomal
Linear Organization Tandem repeat Solitary
along Chromatin
Chromatin Length 2.4 s 0.2;im(N = 24) 4.7 z: 2.6 .um (N = 9) between Transcriptional
Initiation and Termi- nation Sites»
Chromatin Morphology and Average DNA Packing Q afin tnr^
Unbeaded. 1.241m DNA per }im chromatin (rho chromatin)
Beaded. 1.6-1.9 ;im DNA per jim chromatin (nu chromatin)
♦ La structure nucléosomique se caractérise par une compactation du DNA à l'intérieur du nucléosome de 5 fois (voir plus loin) (BELLARD et al, 1 976).
Tout récemment, a été montré que la fréquence d'apparition des