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Texte intégral

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Llopis Sempere, R. (1979). Contribution à l'étude du complexe de transcription tardif du virus SV 40 (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

BIBLIOTHÈQUE DE CHIMIE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Laboratoire de Génétique

CONTRIBUTION A L'ETUDE

DU COMPLEXE DE TRANSCRIPTION TARDIF DU VIRUS SV 40

Thèse présentée pour l'obtention du grade scientifique de

Docteur en Sciences chimiques

Rafael LLOPIS SEMPERE

Janvier 1979

,..x

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Laboratoire de Génétique

CONTRIBUTION A L'ETUDE

DU COMPLEXE DE TRANSCRIPTION TARDIF DU VIRUS SV 40

Thèse présentée pour l'obtention du grade scientifique de

Docteur en Sciences chimiques

Rafael LLOPIS SEMPERE

Janvier 1979

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A un olmo seco, hendido par el raye y en su mitad podrido,

con las lluuias de Abril y el sol de Wayo algunas hojas uerdes le han salido

A. rdacnado

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La presontacidn de este trabajo a side pasible gracias a la buena uolun- tad de cuatrc personas: Réné Thomas, Patricio Gariglio, Pierre Chambon e Hilda- gard Czemper. A todos ellos mis més sinceros agradecirnientos.

El trabajo que constituye esta tesis ha sido realizado en estrecha cola- boracion con Patricio Gariglio. Su concepcién del experimento y su agudeza en el analisis me marcaron para siempre.

Pierre Chambon dirigio y uiuio el trabajo que realizamos. fili paso por su laboratorio ha sido una etapa insustituible en mi formacidn, Sin la ayuda material que en ningun momento me negd, la realizacidn de este trabajo hubiera sido impo- sible. Gracias.

Réné Thomas me acogid en su laboratorio con el desprendimiento que carac- teriza a los profesores de la Licencia Especial en Biologie Filolecular de la Uni- wersidad Libre de Bruselas. En esa Uniuersidad inicié hace seis anos mis prime- ros pasos bioqulmicos. Gracias.

A Hildegard todo.

Toda la parte del trabajo que incluye la microscopia electrdnica fue reali^

zada en estrecha colaboracidn con P.Oudet y F.Perrin. F. Bellard colabord con no- sotros en todas las ualoraciones de la RIMA polimerasa de tipoB.

En Bruselas, Suzane Pilousset me onseîid todo lo que sé en cultiuos colulares.

mis més sinceros agradecirnientos.

Todo el laboratorio de Pierre Chambon ha participado el las correcciones, que han sido muchas, de la uersidn que uid por primera uez la luz. La paciencia de to­

do el mundo ha sido digna de elogio. " Un grand merçi ".

Gracias a la gente que nos ayudo en el trabajo de todos los dias.Los malos mornentos hsn sido siempre superados gracias al esfuerzo de todos.

A Oliuier, niadolein, Jean, marie-Bo et Anne gracias por su amistad.

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TABLE DES MATIERES

Pages

INTRODUCTION GENERALE i

1. STRUCTURE DE LA CHROMATINE

2

1.1. HISTORIQUE 2

1.2. COMPOSANTS CHROMATINIENS 4

1.3. INTERACTION DNA-PROTEINES 9

CHROMATINIENNES

1.3, 1. Le modèle de Kornberg 9

1.3. 1.1. L'action des endonucléases sur la 9 chromatine cellulaire

1. 3. 1. 2. Les diagrammes de diffraction aux IQ rayons-X de la chromatine

1. 3. 1.3. Composition et organisation des 11 histones dans la chromatine

1.3.2. Le nucléosome 13

1.3.2. 1. Contenu en DNA du nucléosome 14 1.3.2. 2. Contenu en histones du nucléosome 15

1.3.3. Anatomie du nucléosome 15

1.3. 3.1. Etudes physiques 16

1.3. 3.2. Coupures des DNAases à l'intérieur I7 du nucléosome

1. 3. 3. 3. L'organisation du DNA à l'intérieur 21 du "core" du nucléosome

2. LA STRUCTURE DU GENE ACTIF

25

2.1. PURIFICATION DE LA CHROMATINE ACTIVE 26 DANS LA TRANSCRIPTION

2.2. PROPRIETES DE LA CHROMATINE ACTIVE 30

DANS LA TRANSCRIPTION

2. 2. 1. Action de la DNAase I : la chromatine active 30 dans la transcription a une conformation altérée

vis-à-vis de la chromatine inerte.

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2.2.2, Action de la nucléase de micrococcus : 32 les régions du génome qui sont actives dans

la transcription contiennent une unité répétitive

2. 2. 3. Le gène actif en microscopie électronique 34 2.2.4. Modification des protéines chromatiniennes 37

3. LE SYSTEME SV 40 43

3.1. CARACTERISTIQUES GENERALES 43

3. 2. LUNFECTION PRODUCTIVE 44

3. 3. PROPRIETES DES RNA VIRAUX SYNTHETISES AU COURS 46 D'UNE INFECTION PRODUCTIVE

3.4. LES COMPLEXES DE TRANSCRIPTION DU VIRUS SV 40 61 AU COURS D'UNE INFECTION PRODUCTIVE

3.4.1. La localisation des complexes de transcription 61 tardifs du virus SV 40

3. 4. 2. Propriétés des complexes de transcription tardifs 63 du virus SV 40, obtenue à l'aide du détergent sarkosyl

3.4.3. La structure des complexes de transcription tardif 66 du virus SV 40

BUT DU TRAVAIL

70

RESULTATS ET DISCUSSION

1. "Isolation and caractérisation of an Active Minichromosome" 71 2. "The Template of the Isolated Native SV40 Transcriptional 73

Complexe is a Minichromosome"

3. "Levels of SV 40 Transcription Complex in Productively Infected Cells"

CONCLUSION

BIBLIOGRAPHIE

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INTRODUCTION GENERALE

Li'un des problèmes que j'ai rencontré au moment d'écrire cette introduction a été l'ampleur du contexte dans lequel il faut situer nos re­

cherches, Le but primitif poursuivi par le groupe qui avait commencé ce travail était de savoir si la transcription tardive de cellules permissives infectées par le virus SV40, se faisait soit sous la forme d'un complexe soluble, soit à l'état intégré dans le génome cellulaire. Les faits ont dé­

montré que la première hypothèse était correcte, mais en même temps, ont mis en évidence que la transcription tardive chez SV40 pourrait être employée comme un modèle hautement privilégié pour les études d'expres­

sion génétique chez les organismes eucaryotes.

Cette introduction portera sur trois points : d'abord on résumera nos connaissances actuelles à propos de la structure de la chromatine chez les eucaryotes, ensuite on examinera la structure du gène qui s'exprime dans une cellule donnée, finalement on verra comment le système SV40 a pu devenir un outil de travail par excellence pour l'étude des problèmes de la structure et des fonctions du matériel génétique chez les organismes supérieurs.

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1. STRUCTURE DE LA CHROMATINE

1. 1. HISTORIQUE

En 1869, le biochimiste suisse Friedrich MIECHER décida d'étu­

dier quel était l'effet de la pepsine sur les cellules du pus. MIECHER qui avait examiné très soigneusement au microscope les cellules avant et après chaque manipulation, observa que la pepsine en milieu légèrement acide digérait toutes les structures de la cellule à l'exception de celle du noyau qui néanmoins diminuait un peu de taille. Il analysa chimiquement les résidus d'une digestion complète et se rendit compte qu'il était en pré­

sence d'une substance fort différente de toutes celles que l'on avait isolées jusqu'à présent d'une cellule. Comme il trouva cette substance dans le noyau, il l'appela nucléine. A Bâle, sa ville natale, il continua ses études mais avec un matériel beaucoup plus privilégié. A l'époque, le Rhin n'était pas aussi pollué que maintenant et des saumons remontaient les eaux à l'époque du frais. Chaque printemps, MIECHER faisait une récole de sperme afin d'étudier les propriétés de la nucléine (le DNA représente 50 % du poids sec des noyaux de spermatozoïdes de saumon). Avec ce ma­

tériel, il put préparer des noyaux propres en plongeant les spermatozoïdes dans des acides dilués ; plus tard, il dut se débarrasser des protéines qui accompagnent toujours la nucléine et ainsi put en déterminer la composition en azote, phosphore, carbone, oxygène et hydrogène.

En 1 944, soixante-seize ans après que MIECHER découvrit l'e­

xistence du DNA, AVERY, MAC LEOD et McCARTY montraient que les propriétés héréditaires du pneumocoque pouvaient être altérées par l'ad­

dition de DNA d'un poids moléculaire élevé (AVERY et al, 1 944). Les généticiens, à l'époque, ne pensaient pas que le DNA avait un rapport étroit avec les phénomènes d'hérédité. AVERY avait vu l'intérêt éventuel de son travail pour la génétique. En 1 943, c'est-à-dire avant même que la parution de son article, il avait écrit à son frère une lettre qui ne laisse aucun doute : le DNA "se présente apparemment comme un virus, mais c'est peut-être un gène" (WYATT, 1 972). L'importance génétique du DNA fut reconnue petit à petit. CHAR GA FF, qui était

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biochimiste, s'oriente très vite vers l'ètude des acides nucléiques et avec ses collaborateurs, il fut capable, en appliquant des méthodes chromato- graphiques quantitatives, de déterminer la composition en bases puriques et pyrimidiques de DNAs de sources différentes. Le résultat était clair : les proportions relatives des quatre bases ne sont pas distribuées au hasard. La quantité d'adénine dans un échantillon de DNA était toujours trouvée égale à la quantité de thymine et la quantité de guanine égale à la quantité de cytosine. Alors que les rapports A/T et G/C sont toujours égaux à 1, le rapport A + T / G + C varie énormément avec les espèces étudiées (ZAMENHOF et al, 1 952). La signification fondamentale de ces relations ne devint claire que lors qu'on prêta attention à la structure tertiaire du DNA.

Vers 1 949-1953, la biologie allait s'approprier la phrase du physicien Heinrich HERTZ : "Nous nous formons une image idéale inté­

rieure, ou symbole des objets extérieurs, et nous le faisons de telle sorte que les conséquences imaginaires qui nécessairement dérivent de l'image soient toujours les conséquences nécessaires dans la nature des objets observés". WATSON et CRICK surent réunir toutes les données chimiques, cristallographiques et génétiques que l'on avait sur le DNA, et proposèrent leur modèle de la double-hélice (WATSON et CRICK, 1 953). Celle-ci est formée de deux brins complémentaires - une adénine est toujours opposée à une thymine et une guanine à une cytosine - qui le cas échéant peuvent se séparer et chacun constituer une matrice pour une chaîne fille complémen­

taire. Ce modèle, qui était extrêmement simple, pouvait expliquer en termes moléculaires des problèmes aussi importants que la réplication conservative des gènes. La double hélice possède de plus toutes les carac­

téristiques essentielles du support génétique ; spécificité, grâce à la sé­

quence de bases puriques et pyrimidiques ; mutation par modification de cette séquence ; et expression en terme de fonctionnement cellulaire par la transcription d'un des brins en une chaîne complémentaire d'acide ribo- nucléique (JACOB et MONOD, 1961), laquelle plus tard, dirigera l'assem­

blage des acides aminés en enzymes et autres protéines grâce aux ribosomes.

En regardant la clarté, l'élégance et les résultats qui se sont déduits de ce

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modèle de WATSON et CRICK, il est facile de comprendre, comme le fait remarquer P. CHAMBON (CHAMBON, 1 977), la frustration de ceux qui se sont occupés des problèmes d'expression génétique chez les organismes supérieurs. Si la connaissance de la structure du DNA a permis de se faire une idée de sa fonction biologique, on peut attendre que la connaissance dé­

taillée de la structure de la chromatine fasse de même à propos de la régu­

lation des gènes.

1.2. COMPOSANTS CHROMATINIENS

Le terme chromatine se réfère au complexe formé par du DNA, du RNA et des protéines présents dans les noyaux des cellules d'eucaryotes en interphase. L'élucidation de la structure de ce complexe est due aux connaissances acquises ces dernières vingt années à propos des protéines chromatiniennes, et aux considérables progrès techniques qui se sont faits parallèlement pour mesurer les interactions DNA-protéines.

Il y a deux sortes de protéines chromatiniennes ; la première, fortement basique, peut être aisément extraite, soit de la totalité d'un tissu, des noyaux ou de la désoxyribonucléoprotéine, à l'aide de l'acide sulfurique

0, 1 - 0, 5 N : ce sont les protéines dites histoniques. Le deuxième type peut être séparé de la désoxyribonucléoprotéine "déshistonée" à l'aide du SDS 1 % : ce sont les protéines dites non histones. La table 1 montre que dans la composition chimique de la chromatine de différentes sources, il y a autant de protéines histoniques que de DNA à quelques exceptions près, tandis que la quantité des protéines dites non histones est beaucoup plus variable.

Table 1 (BASERGA et NICOLINI, 1 97é)

C:itIMiCAI COMrOSirrON OF CUKOMAIirN (i.-, DNA)

•n,^..ioofon-,a HHionci Non-hi .îoncs Ct'icLcn

CliiCr.on îivcr Chickon c/ythrocylc .Soa i;rc!ii.", spei m

Km

C;iir thyîinis M.-La ccüs

i\’2 rro'Aintj cot>Ictlon Î’i'î ccîcl'cÜnm Kjt kiLÎr.cy flinta.T fibrobîasis

os 1.9

o.so 1.2

0.S4 0.36

1.02 0.13

I.ÜO 0.67

1.14 0.33

1.02 0.71

0.76 0.36

1.6!) o.:o

0.9i 0.70

I.CO 0.98

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Une première étape pour l'élucidation de la structure et de la fonction de la chromatine est nécessairement l'isolement et la caractérisa­

tion des différentes sortes des protéines chromatiniennes. En ce qui con­

cerne les histones, des progrès considérables ont été faits après que RASMUSSEN, MURRAY et LUCK (RASMUSSEN et al, 1 962) démontrèrent qu'un petit nombre de fractions non artéfactuelles était présent dans la chromatine de thymus de veau, FAMBROUGH et BONNER (FAMBROUGH et BONNER, 1 966) comparèrent des histones de thymus de veau et de petit pois et arrivèrent dans les deux cas par chromatographie échangeuse d'ions à trois fractions majeures : des histones riches en lysine, des histones moyennement riches en lysine et des histones riches en arginine. Chaque fraction (de petit pois ou de thymus de veau) a une composition similaire en acides aminés, un groupe N-terminal identique et un comportement électro­

phorétique similaire. Des électrophorèses réalisées à l'aide de gels de polyacrylamide en présence d'urée ont montré qu'il y a seul-

lement cinq fractions de protéines histoniques présentes dans virtuellement toutes les cellules eucaryotes (PANYIM et CHALKLEY, 1 969). Ces cinq fractions nommées H 1 (fraction riche en lysine), H2a et H2b (fractions moyennement riches en lysine), H 3 et H 4 (fractions riches en arginine) peuvent encore être résolues.dans des longs gels de polyacrylamide

(PANYIM et CHALKLEY, 1 969). Dans le cas des histones riches en lysine (H1 ), une microhétérogénéité reflète des petites différences dans la séquence de leurs acides aminés (KINKADE et COLE, 1 966 ; RALL et COLE, 1 971).

Dans tous les autres cas, la principale microhétérogénéité présente pour un tissu donné est due à des modifications chimiques de leurs acides aminés.

Ces modifications qui sont introduites par des enzymes spécifiques après la synthèse de la chaîne polypeptidique, comportent des acétylations, des mé­

thylations, des phosphorylations et poly-ADP-ribosylations (DE LANGE et SMITH, 1971 ; ALLFREY V.G., 1 977).

Les analogies de comportement pour les histones de différentes sources furent comprises à la suite des études qui menèrent à l'élucidation de leurs séquences. La première histone dont on a connu la séquence fut l'histone H 4 de thymus de veau (OGAWA étal, 1969; De LANGE étal, 1 969).

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Presqufeiu même moment, l'histone H 4 de thymus de porc (SAUTIERE et al, 1970), de tumeur de chloroleucémie du rat (SAUTIERE et al, 1971), de l'hé- patome de Novikoff (WILSON et al, 1 970) et de petit pois (DeLANGE et al, 1969) furent séquencées. Dans les trois premiers cas, les séquences sont identiques à celle du thymus de veau ; dans le cas du petit pois, il y a seu­

lement deux changements parmi les 102 résidus ; une isoleucine s’introduit à la position 60 à la place d'une valine et une arginine à la position 77 à la place d'une lysine. Il faut remarquer la ressemblance chimique d'une part de la valine et de l'isoleucine et de l'autre de la lysine et de l'arginine.

Des histones H 3 de différente origine ont également été séquencées celle du thymus de veau (DeLANGE et al, 1 972, 1 973), de testicule de carpe (HOOPER et al, 1 973) et celle du petit pois (PATTHY et al, 1 973). Les dif­

férences existant pour des histones H 3 d'origine différente sont présentées dans la figure 1 a.

Figure 1 a

Residiies «hidi ditTer in histones H3 (III) from ditTcrent sources

Source Reskhie

41 53 90 96

Calf thymu$“ Tyr Arg Met Cys

Carp iestis“ Tyr Arg Met Ser

Pea scedling'' Phs Lys Ser (Ala (60°^)

|Ser (40%)

“ Sec DoLange et al. (1972, 1973)

* Sce Hooper et al. (1973)

‘ Sec Patthy et al. (1973)

Une fois de plus, la nature surprend ceux qui l'étudie par sa sim­

plicité. Les histones H4 et H 3 sont de toutes les protéines étudiées jusqu'à présent celles qui ont subi le moins de changements dans l'histoire de l'é­

volution. D'après DAYHOFF (DAYHOFF, 1 976), elles ont changé seulement 0, 09 et 0, 12 résidus par 100 résidus chaque 100 millions d'années. Le cyto­

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chrome C, une protéine hautement spécialisée et conservée au cours de l'évolution, évolue 30 fois plus vite. L'invariabilité des séquences de ces protéines suggère fortement que leur rôle ne doit pas être celui d'un ré- presseur spécifique (STEDMAN et STEDMAN, 1 950), mais plutôt celui d'un composant structurel.

Les séquences des différents types d'histones moyennement riches en lysine H2a et H2b ont été déterminées ces cinq dernières années. Dans les deux cas, ces deux histones manifestent au cours de l'évolution un

rythme de changement équivalent à celui du cytochrome C (SAUTIERE et al, 1975 ; KOOTSRA et BAILEY, 1 978).

Sauf pour de rares exceptions (SAUTIERE et al, 1971 ; PATTHY et al, 1 973), il a longtemps été impossible pour un tissu donné de mettre en évidence des variations de la séquence peptidique des différentes histones H 3, H4, H2a et H2b. Ceci laissait penser à une absence de spécificité de fonction pour ces quatre protéines. Des nouvelles techniques - gels de poly- acrylamide en présence de triton X-100 - ont démontré qu'il existe dans la chimie des histones toute une série de nuances, qui sont encore loin d'être comprises et qui peuvent changer nos conceptions sur la structure et la fonc­

tion de la chromatine.

Différentes fractions, enrichies en une histone particulière, ont été isolées du thymus de veau et d'autres tissus de différents mammifères et ont été analysées au moyen de gel de polyacrylamide en présence du triton X-100 (ZWEIDLER, 1 977). Les études des différentes fractions ont conduit à la découverte que des variations d'un à trois acides aminés

existent dans les histones H2a, H2b et H 3 pour un tissu donné (FRANKLIN et ZWEIDLER, 1975, 1 977). En général, ces variations (voir figure Ib) ont été trouvées pour tous les tissus examinés de n'importe quel mammi­

fère, bien que leurs proportions relatives varient d'un cas à l'autre (ZWEIDLER, 1 977).

(15)

Figure 1 b (ZWEIDLER, 1 977)

Comparison of the histones of mouse thymus (a ) and mouse liver (6)as rcsolved by electrophoresis (from lefi lo righoon 12“o polyacrylamide gels containing 7.5 M urea, 6 niM Triton X-100 and 5% acetic acid. The proteins v».ere stained with amido black.

and the gel scanned at 300 nm. 1,2a. 2b. 3. and 4 = major histone spccies; .1, .2. .3 — variants of a givcn histone species; Ml.

M2, M3, M4 = minor histone species with propcriies character- istic for histones but amino acid compositions not closciy related toanyofthefivemajorhisioncspecies“; HMG ~ *high mobility group’ proteins*'; a = acetylaied. p » phosphor>laied forms.

Note the différence in the relati\e amounts of H2a.l againsl H2a.2, H2b.l against H2b.2, H3.I against H3.2 and H3.3 in the

twotissues.

La présence de tous ces variants dans quelques cas indique que les gènes pour les différentes histones sont non-allèles. L'observation que les dif­

férents variants des histones H23- et H2b sont synthétisées au cours des différents stades de l'embryogenèse (BORUM et al, 1 975, 1 976) fait penser à la présence de différents opérons. Un fait qui est sans doute remarquable c'est la conservation de ces différents variants au cours de l'évolution ; cela fait penser que cette hétérogénéité joue un rôle déterminant dans la structure et la fonction de la chromatine et suggère, de ce fait, que les propriétés particulières de certaines régions du génome peuvent être dues à une distribution particulière des différents variants trouvés.

Si seulement un à trois variants des histones H2a, H2b, H3 et H 4 ont été mis en évidence pour un tissu donné, la situation est beaucoup plus complexe dans le cas des histones riches en lysine (Hl). KINKADE et COLE ont pu fractionner les histones riches en lysine de thymus de veau en quatre composants qui ont une composition similaire en acides aminés et une masse molaire d'environ 21 000 daltons (KINKADE et COLE, 1 966).

(16)

Chaque tissu possède plusieurs formes d'histones H1 qui varient quantita­

tivement d’un tissu à l'autre et qualitativement d'une espèce à l'autre. Des isohistones H 1 de différents tissus présentent des réactions immunologiques croisées pour une espèce donnée (BUSTIN et STOLLAR, 1 973 ; SLUYSEZ et BUSTIN, 1974). Pour des espèces différentes entre trois et huit variants ont été trouvés pour un tissu donné. Ces variants présentent parfois des différences importantes au niveau de leurs compositions en acides aminés et de leurs séquences (KINKADE, 1 969 ; SLUYSER, 1977). Deux problèmes majeurs expliquent qu'à l'heure actuelle on ne dispose d'aucune séquence complète pour l'histone Hl. En premier lieu, cette microhétérogénéité au niveau des histones H 1 rend difficile l'isolement d'une isohistone donnée.

Le deuxième problème réside dans le fait que plus de 50 % des acides ami­

nés sont des lysine s et des alanine s.

1.3. INTERACTION DNA-PROTEINES CHROMATINIENNES

1.3.1. Le modèle de KORNBERG

Trois orientations, ont apporté les informations nécessaires qui ont permis à R. G. KORNBERG de proposer son modèle sur la structure de la chromatine :

1.3. 1. 1. L^_çUoi^des_er^£rm£^a£es_^^_la £hrpjna^me__ce_U3U^i££

Les noyaux de foie de rat possèdent une endonucléase capable de +2 +2

digérer le DNA en présence des ions Ca et Mg (BURGOYNE et al, a_ et b, 1970). Lorsque le DNA dégradé "in situ" par cette endonucléase est purifié et analysé sur gel de polyacrylamide, on observe une série de bandes dont la masse moléculaire correspond à un multiple de celle de plus

grande mobilité (HEWISH et BURGOYIŒ, 1 973) (voir figure 2). Au cours de la digestion le DNA contenu dans la bande correspondante au monomère augmente progressivement. Cette unité répétitive est due à l'interaction nucléoprotéique et non au DNA seul, car lorsqu'à l'aide de cette endo­

nucléase Ca-Mg dépendante on digère du DNA nu, on ne retrouve aucune de ces bandes. La sédimentation de ces fragments de DNA a permis de déterminer un contenu en DNA, dans les particules monomériques, de 180

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of nuclei luith micrococcal nuclease ( Compton et al,1976

).

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à 230 paires de bases (BURGOYNE et al, 1974). NOLL à Cambridge, par une approche similaire à celle d’HEWISH et BURGOYNE, trouve qu’au moins 85 % de la chromatine peut être converti en sous-unités à l'aide de la nucléase de micro-coccus. La taille de ces fragments, calibrée à l'aide des fragments séquencés du phage ^ X 174, s'avère être un multiple de

205 paires de bases (NOLL, 1 974).

L'explication donnée par HEWISH et BURGOYNE aux résultats décrits ci-dessus résume nos connaissances actuelles sur le premier

niveau d'organisation de la chromatine chez les eucaryotes. ". . . chromatin has s orne simple, basic, repeating substructure with a répétitive spacing of

sites that are potentially accessible to the Ca-Mg endonuclease. However, some of these sites are sterically blocked by superstructure proteins. Thus the Ca-Mg endonuclease would produce fragments which were ail equal to or greater than, the basic substructure repeat distance and the larger ones would be ail multiples of the smallest. The smallest would represent the substructure repeat distance" (HEWISH et BURGOYNE, 1 973).

1. 3. 1.2. Le_^diag]^rnrnesjdejiHUr^_tion au^r^^n^-_Xj:^_l^_c

L'idée que l'ensemblage des histones et le DNA comporte une unité répétitive remonte à l'année 1956 où WILKINS et collaborateurs observèrent que les diagrammes de diffractions aux rayons-X, obtenus à partir de

noyaux purifiés, présentaient des réflections relativement aiguës (WILKINS, 1956). Les diagrammes de diffraction obtenus à partir de chromatine puri­

fiée sont similaires à ceux obtenus à partir de noyaux et comportent en par­

ticulier une réflection à 1 0 nm (LUZZATI et NICOLAIEFF, 1 963 ; RICHARDS et PARDON, 1 970).

^ Une excellente discussion de tous les problèmes concernant l'interprétation de ces diagrammes peut être trouvée dans "The structure and function of chromatin". Ciba Foundation Symposium 28, 23-28 (1975).

(19)

A la lumière de ces résultats cristallographiques, PARDON et WILKINS ont proposé un modèle où une double hélice de DNA est enroulée en hélice avec un pas de 1 2 nm et un diamètre de 1 0 nm (PARDON et WILKINS, 1972). Cette interprétation des données de diffraction aux rayons-X n'est pas nécessairement la seiile ; n'importe quel modèle com­

portant une répétition chaque 10 nm est aussi valable que le modèle de PARDON et WILKINS. Evidemment, des informations supplémentaires sont nécessaires pour pouvoir proposer un modèle plus fin.

1.3. 1.3. Çomp^qsJ±^qn_et_j5j;g_^Jj^^mn^e^^hij^ne^d^j_l^^h^jt^^m£

Lorsque l'on fait le rapport histones/DNA (voir table 1) dans la plupart des cas étudiés, on trouve des valeurs très proches de l'imité. La quantité relative de chaque histone de diverse origine est connue (JOHNS, 1 967 ; PANYIM et CHALKLEY, 1 969 ; OLIVIER et CHALKLEY, 1972 ; FAMBROUGH étal, 1 968). Dans tous les cas étudiés, les histones H 3, H 4, H2a et H2b se présentent en quantités équimoléculaires (les variations observées pourraient être attribuées à des problèmes de détermination expérimentale). L'histone H1 serait présente à raison d'une molécule d'his- tone H1 pour deux molécules des histones H2a, H2b, H 3 et H 4. Bien que toutes ces déterminations puissent être entachées d'un grand nombre d'er­

reurs, elles conduisent à conclure que, dans la chromatine il doit y avoir, pour chaque 200 paires de bases de DNA, deux molécules de chacune des histones H 3, H 4, H2a et H2b et une molécule de l'histone Hl.

Jusqu'à 1971, les histones ont été couramment obtenues à l'aide des acides forts, des solvants organiques et du chlorure de guanidine, tous de puissants agents dénaturants. Dans ces conditions, les histones forment de grands agrégats (BARCLAY et EASON, 1 972) qui se lient non spécifique­

ment au DNA. L'emploi de méthodes d'extraction ne comportant pas d'agents dénaturants (WESTHUYZEN et VON HOLT, 1971) ainsi que la mise au point de réactifs de pontage (DAVIES et STARK, 1 970) a permis la caractérisation de l'organisation oligomérique des histones. L'extraction des histones en 2 M NaCl, suivie d'une filtration sur Sephadex G-lOO (KORNBERG et THOhiAS 1974) ont permis de séparer les histones de thymus de veau en deux fractions,

(20)

Par pontage au diméthyl subérimidate, ces auteurs ont pu montrer que la première fraction contient les histones H3 et H4 sous la forme d'un tétramère (H4) (H3) , alors que la deuxième contient essentiellement un mélange des

U

histones H2a, H2b etHl.

A l'époque, la présence du tétramère (H4) (H3) dans la chromatine a été surtout suggérée par ses conséquences . En tenant compte de la compo­

sition de la chromatine (voir table 1) et de la présence du tétramère

l'unité respective comporterait 200 paires de bases. Cette prédiction est con­

firmée par les travaux de HEWISH, BORGOYNE et NOËL (HEWISH et BURGOYNE, 1 974 ; NOËL, 1 974).

Ees histones H2a et H2b sont-elles associées au tétramère ^ et aux paires de bases de l'unité répétitive ?

Ees expériences de reconstitution, faites avec du DNA et le tétra­

mère, avec le DNA et le mélange des histones H2a et H2b, et avec le DNA plus le tétramère plus le mélange des histones H2a et H2b, montrent

(figure 3) que la seule façon de régénérer le diagramme typique de la chro­

matine est d'associer les quatre histones H4, H3, H2a et H2b (KORNBERG et THOMAS, 1 974).

Figure 3 A la lumière de tous ces résultats,

R. D. KRONBERG propose : "... the structure of chromatine is based on a repeating unit of two each of the four main types of histone and 200 base-pair of DNA. This is the simplest model compatible with ail the facts" (Sympo­

sium on the Structure and Function of Chromatine held at the Ciba Foundation,

Eondon on 3rd-5th April, 1 974).

♦ R. D. KORNBERG fait une discussion particulièrement pédagogique à propos de ce point. "The Structure and Func­

tion of Chromatine". Ciba Foundation Symposium 28, 1 975 (41 -56).

____ 1______ I_______[___________________________

10.0 5.0 3.3 nm

('Kornbcri:). ,X-ray dilTr.nction patterns of chromatin and of complexes of histones witi DNA. Histones and calf thymus DNA were mi.xed in 2\i-NaCI-0.1 \i-sodium phosphate pH 7.0, dialysed against 0.15M-NaCl-O.Ü25\i-sodium phosphate. pH 7.0, and eentrifiiged X-rav ohotoeraohs uere densitometered and the oplieal densities radially integrated.

(21)

1.3.2. Le nucléosome

L'existence de l'unité répétitive proposée par KORNBERG est à l'heure actuelle un fait établi (KORNBERG, 1977 ; THOMAS, 1 977 ; CHAMBON, 1 977). L'aspect en microscopie électronique de cette unité répétitive dépend des conditions de préparations de la chromatine étudiée.

O

Des particules d'environ 70 A de diamètre visualisées par microscopie électronique d'une chromatine dans un état partiellement étendu ont été dénommées "nu-bodies" (OLINS et OLINS, 1974). Des particules d'environ

O

125 A de diamètre visualisées par microscopie électronique d'une chroma­

tine dans un état plus compact ont reçu le nom de nucléosome (OUDET et al, 1 975) (voir plaque 3)*.

Les preuves les plus solides de l'existence du nucléosome viennent de deux lignes de travail parallèles. En premier lieu, une correspondance univoque a été établie entre la strucutre nucléosomique visualisée par mi­

croscopie électronique et l'unité répétitive obtenue par digestion à la nu- cléase de micrococcus (OUDET et al, 1 975 ; FINCH et al, 1 975). En se­

cond lieu, le "core" du nucléosome (voir plus loin) a été isolé (RILL et VAN HOLDE, 1 973 ; NOLL et KORNBERG, 1 977) et cristallisé (FINCH et al, 1 977). La réalité du cristal a été établie par microscopie électronique

O

et par diffraction aux rayons-X à 20 A de résolution (FINCH et al, 1977).

Il est très probable que la périodicité nucléosomique existe "in vivo" (on pourrait toujours imaginer que la périodicité trouvée en micro­

scopie électronique ou après l'action de la nucléase de micrococcus est de nature artéfactuelle). A cet égard, l'action du psoralène et de ses dérivés constitue un outil de travail unique. Ce réactif est capable de ponter les deux brins de DNA *'in vivo" (HANSON et al, 1 976). Ce pontage ("cross- linking") se fait à des intervalles égaux au contenu du nucléosome

(WIESEHAHN et al, 1977 ; CECH et PARDUE, 1977) (voir schéma 1).

+ Il est possible que la particule visualisée par OLINS et OLINS ("nu-bodies") dérive du nucléosome. En effet, lorsque les nucléosomes sont exposes a très basse force ionique, ils donnent lieu à des particules appelées demi- nucléosomes d'environ 90 A de diamètre (OUDET et al, 1 977).

(22)

nuclei lysed diroctly on a grid ( Oudet et al,1975 ).

(23)

Schéma 2 (HANSON et al, 1 976)

J\ x>

Psoralen + ultraviolet (high dose)

isolated DNA

Dénaturé E.M.:I

, 1.3. 2. 1. Contenu en DNA du nucléosome

Table 2 (CHAMBON, 1977) ---

DNA Content of Nucléosomes Le contenu en DNA de l'unité répéti­

DNA repeat length

Cell type (base pairs)

Aspergillus 154

Yeast 165, 163

Rabbit cortical neuron 162

Neurospora 170

Physarum 171, 173

Tetrahymena micronucleus 175

Cells grown in culture

CHO 177

HeLa 183, 188

hepatoma 188

teratoma 188

P815 188

myoblast 189

CVl, exponentiall>*growing or confluent 189’

BHK 190’

rat kidney primary culture 191'

myotube 193

C6, exponentially growing or confluent 198

Rat bone marrow 192

Rat fêtai liver 193'

Rat liver 198, 196

Rat kidney 196

Syrian hamster liver 196

Syrian hamster kidney 196

Chick oviduct 196

Tetrahvmena macronucleus 202

Rabbit cerebellar neuron 200

Rabbit nonastrocjtic glial cells 200

Stylonvchia micronucleus 202

Chicken erythrocvte 207, 212

Sea urchin gastrula 218

Stylonychia macronucleus 220

Sea urchin sperm 241

tive obtenu à l'aide de la nucléase de micro- coccus a été déterminé, dans la plupart des cas étudiés, comme étant d'environ 200 paires de bases*. Une grande variabilité a été néan­

moins observée dans quelques cas (voir table 2).

Bien que diverses possibilités aient été envisagées pour rendre compte de ces va­

riations, telles que la variabilité de l'histone Hl, aucune interprétation n'a été confirmée jusqu'à présent par l'expérimentation.

4 Une discussion des difficultés inhérentes à ce genre de déterminations a été faite par

KORNBERG (KORNBERG, 1 977).

(24)

1. 3. 2. 2. Çor^£im_en_lnst^nes_du_im

Les prédictions du modèle de KORNBERG en ce qui concerne la composition en protéines histoniques du nucléosome ont été confirmées.

A l'aide des expériences de reconstitution, on a démontré que les quatre quatre histones H 4, H 3, H2a et H2b étaient nécessaires et suffisantes en

O

quantité équimoléculaire, pour régénérer un nucléosome de 125 A de dia­

mètre (OUDET, 1978). Si seulement trois des histones sont présentes tout au long de la reconstitution, il n'y a pas formation des nucléosomes (on

O

n'observe pas en microscopie électronique la particule de 125 A de dia­

mètre)^. Au fur et à mesure que la quatrième histone est ajoutée, les nu­

cléosomes commencent à se former dans la proportion de l'histone ajoutée.

Le "core" protéique du nucléosome a été caractérisé (THOMAS et KORNBERG, 1975 a, b ; THOMAS et BUTLER, 1 977). Sa composition dé- duite des expériences de pontage soit avec la chromatine, soit avec des nu­

cléosomes isolés, est en accord avec l'existence d'im octamère dont la for­

mule empirique serait (H4) (H3) (H2a) (H2b) . La masse moléculaire du C* C* w

"core" protéique, isolé de la chromatine à haute force ionique, a été déter­

minée (THOMAS et BUTLER, 1 977). Sa valeur, 107 000 - 7 700, corres­

pond à celle de l'octamère.

1.3.3. Anatomie du nucléosome

Le contenu en DNA du nucléosome dépend de l'organisme, du tissu, et peut-être de l'état d'activité génétique du génome (COMPTON et al, 1 976).

Cependant, si on laisse la digestion par la nucléase de micrococcus se pour­

suivre, au-delà de l'état de mononucléosome, on obtient une particule sub- nucléosomale bien définie que l'on appelle coeur du nucléosome ("Core par- ticle") qui contient la totalité des histones du nucléosome intact à l'exception de l'histone H 1 et 140 paires de base de DNA (SOLLNER-WEBB et

FELSENFELD, 1 975 ; SWAW et al, 1 976 ; SIMPSON et WHITLOCK, 1 976 ; NOLL et KORNBERG, 1 977). Tous les nucléosomes, indépendamment de

+ Les histones H 3 plus H4 peuvent compaçter environ 130 paires de bases de DNA dans une particule d'environ 80 A de diamètre (OUDET et al, 1 978).

(25)

de l’origine de leur chromatine donnent ce "core particle". Le DNA res­

tant qui joint un "core particle" au suivant, reçoit le nom de DNA inter- nucléosomique ("linker"). Nos connaissances actuelles à propos de l'ar­

chitecture interne du "core" du.nucléosome dérivent des deux lignes de travail différentes. Premièrement, les techniques physiques de diffraction de neutrons et de diffraction de rayons-X ont permis de se faire une idée sur la géométrie de la particule ; deuxièmement, l'action extrêmement spécifique de quelques nucléases a révélé toute une série de détail de son organisation interne.

1. 3. 3. 1. E^^e_i^2l^_si^e^^

La technique de diffraction des neutrons a apporté des renseigne­

ments précieux concernant la localisation relative du DNA et des protéines à l'intérieur du nucléosome et du core du nucléosome (HJELM et al, 1 977 ; BRADBURY et al, 1 977 ; PARDON et al. 1 975 et 1 977 ; SUAU et al, 1 977).

La forme du "core" du nucléosome, qui coiiicide le mieux avec les courbes

O

du diffraction des neutrons, est un disque qui a approximativement 100 A

O

de diamètre et 55 A d'épaisseur. Dans la technique en question, on peut obtenir séparément les dimensions du DNA ou du "core" protéique. Autant dans les nucléosomes que dans le "core particle", le DNA a toujours une dimension plus grande que l'ensemble protéique ; cela implique que le DNA de la sous-unité de la chromatine est enroulé autour d'un noyau constitué d'histones. Bien que d'autres modèles puissent être proposés, les données de la diffraction des neutrons sont en accord avec un DNA qui ferait 1,75 tours par "core particle" en formant une hélice régulière ou légèrement

O O

déformée d'un diamètre de 90 A et d'un pas de 30 A. FINCH et collabora­

teurs, par une étude combinée de diffraction des rayons-X et de micro­

scopie électronique du "core" du nucléosome cristallisé ont fourni une

O

preuve directe de ce modèle. Quoique la résolution ne dépasse pas les 20 A et qu'en conséquence il n'est pas possible de distinguer le DNA des pro­

téines, le core du nucléosome se présente pour ces auteurs comme étant

O O

une particule qui a la forme d'un disque de 1 10 A de diamètre et 57 A d'épaisseur arrangé en deux moitiés symétriques autour de son axe le plus court (FINCH et al, 1977). Ces résultats sont en excellent accord avec le

(26)

modèle déduit des expériences de diffraction de neutrons (faites avec le

"core" du nucléosome en solution). Il semble pourtant que les structures du core du nucléosome en solution et au sein d'un cristal sont très simi­

laires. Si l'on cons.idère que les 140 paires de base forment une super- hélice uniforme autour d'un cylindre des dimensions données précédemment,

O O

la superhélice doit avoir un diamètre de 90 A et un pas de 28 A . Un tour

de superhélice comporterait entre 75 et 82 paires de bases de DNA en forme B.

WEINTRAUB et collaborateurs avaient suggéré une double symétrie du nucléo­

some. Ces auteurs ont aussi suggéré que le nucléosome peut s'ouvrir en deux

" parties ("demi-nucléosomes") afin de permettre la transcription et la répli­

cation du DNA (WEINTRAUB et al, 1976). Deux types d'arguments appuient la nature "bipartite" du nucléosome. ALTENBURGER et collaborateurs ont montré que la chromatine peut être coupée à intervalles de 100 paires de bases par la DNAase II (ALTENBURGER et la, 1 976). OUDET et collabora­

teurs ont signalé, dans des conditions de très faible force ionique, la pré­

sence de "demi-nucléosomes" sur des clichés de microscopie électronique (OUDET et al, 1 977) (voir plaque 4)*.

1.3. 3. 2. G2.’qPB£.^_des_DN^_se^^à i^'int£ri£imjdu_nu^

Des informations complémentaires concernant la structure fine du nucléosome et du core du nucléosome peuvent être obtenus à l'aide de nu- cléase qui se sont révélées capables de couper le DNA à l'intérieur même du nucléosome d'une manière hautement spécifique : la DNAase I (NOLL, 1974b) ; la nucléase de micrococcus (AXEL et al, 1974 ; CAMERINI-OTERO et al, 1 976) ; la DNase II (SOLLNER-WEBB et al, 1 976) ; les endonucléases endogènes (SIMPSON et WHITLOCK, 1976 b).

+ Le minichromosome du virus SV40 contient entre 20 et 24 nucléosomes de 125 A de diamètre (BELLARD et al, 1 976) (voir plus loin). Lorsque ces minichromosomes sont incubés à très basse force ionique, on observe des minichromosomes de taille normale mais contenant entre 40 et 50 particules

O

de 90 A de diamètre.

(27)

cells in a lom ionic strength buffer ( Oudat et al, 1978 ).

(28)

of nuclei mith DNAase I ( lYlathis et al,1978 ).

(29)

Lorsque l'on traite des noyaux purifiés avec de la DNAase I, on obtient une série de framents de DNA. Ces fragments, une fois dénaturés, migrent électrophorétiquement sous forme de bandes discrètes possédant un nombre de nucléotides multiple de dix (NOLL, 1 974 b) (voir figure 4).

Si l'on fait le même genre d'expérience avec du DNA nu, même à des rap­

ports enzyme-substrat 10 fois plus bas, le DNA est dégradé en fragments plus petits que 10 nucléotides. Cela signifie que l'effet décrit ci-dessus dépend de l'interaction histones-DNA. L'existence de ces fragments monocaténaires d'un nombre de nucléotides multiple de 10, n'implique pas que le nucléosome présente des sites accessibles tous les 10 paires de bases sur chacun de deux brins de DNA (par exemple, on peut imaginer l'existence de sites de coupures placés aux positions 10, 20, 60, 90 et 110 paires de bases des extrémités d'un "core" du nucléosome : tous les frag­

ments compris entre 1 0 et 140 bases pourraient être obtenus (voir figure 5a).

Figure 5 a (LUTTER, 1978)

10 20 ÎO 40 50 60 70 80 90 !00110120130140

10 »—__

20 »--- --- 30 --- --- 40 ---

50 --- --- ■' 60 »---

70 ---

80 --- --- 90 »--- ..--- 100 --- —-

110 *--- 120 ---—---

130 --- ---

Hypothetical cuttiiig |)iitteni to show how ail 14 possiblo DXA fragment lengths can arise from a suhset of dits in the nucleosoino core DXA.

A single Btraïul of the 140 hase-pair DXA of the nneleo.sonie cote is shown at the top with arrow.s reprc.sonting DXase 1 attack at 5 of the 11! sites which are loeatcd at ilistancc.s of 10;i bases from the 5' end. Below tins is shown how, in a partial iligest, varions combinations of tins par- ticular sub.set of cuts coiild produco fragments in every si/.e class. Thus it can be seen that tho distribution of fragment sizes says little about the location ami nuuiber of cuts that produced them. However, by labellitig the end of the nucléosome DN'.V with ^-1’ (indicated by x) it can be secn that the labelled fragments in a DXase 1 digest direetly locale the sites of enzyme attack with resnect to the end of the DX.V.

Les diagrammes électrophorétiques ainsi obtenus sont un reflet de la fré­

quence relative des fragments compris entre deux sites de coupure. Ces diagrammes ne permettent pas de déterminer la localisation précise des sites des coupures. Pour résoudre ce problème, le DNA du "core" du

nucléosome a été marqué au p à l'extrémité 5', digéré avec des nucléases

(30)

et le DNA résultant analysé sur gel à l'aide d'une autoradiographie

(SIMPSON et WHITLOCK, 1976 ; LUTTER, 1977 a,; 1978 ; NOLL, 1 977).

La position de chaque bande sur l'autoradiogramme reflète la distance de l'extrémité 5' au point de coupure ; l'intensité de chaque bande donne une idée de la sensibilité relative de chaque site de coupure. De telles expé­

riences menées avec la DNAase I ont conduit aux résultats suivants :

1. Tous les sites du "core" du nucléosome multiple de dix nucléo­

tides, sauf peut-être les sites 80 et 110 par rapport à l'extrémité 5', sont accessibles à l'action de la DNAase I (voir figure 5b). Ceci rend impossible des modèles qui supposeraient qu'une quantité importante du DNA soit enfouie, à l'intérieur du "core" du nucléosome.

Figure 5b(LUTTER, 1977 a)

02-

Rate constants of DNase-I attack at each site.

Apparent first-order rate constants for each site were deter- mined from the data in Fig. 6 (see Experimental Proce­

dures). The numbers on the abscissa refer to distances in / bases from the 5' end of the DNA, and the values on the ordinate refer to the apparent first-order rate constant k in reciprocal seconds.

2. Tous ces sites ne sont pas accessibles de façon identique à la DNAase I. Certains sites sont très résistants, comme par exemple les sites

30 et 110 ; d'autres le sont beaucoup moins (par exemple les sites 50 et 130).

Ces études ont permis de montrer que l'accessibilité de deux sites distant de 80 nucléotides était très similaire (voir figure 5b). Aux points où l'attaque est relativement peu fréquente, la répétition est particulièrement claire : les sites 30 et 110 sont très résistants à l'attaque quand on les compare avec des sites adjacents. Si les extrémités de la molécule sont considérées comme des sites résistants (cela suppose en fait une pause dans la digestion de la nucléase de micrococcus) une autre répétition claire de 80 nucléotides est trouvée entre les sites relativement résistants à l'action de la DNAase I :

les sites 0 et 80, 60 et 140 (LUTTER, 1 977 a, 1 978).

(31)

Quel est le sens de cette réitération de 80 nucléotides en ce qui concerne l'accessibilité de la DNAase I ?

Les dimensions du "core” du nucléosome déduite par méthodes physiques (voir page 17) implique entre 75 et 82 paires de bases par tour de superhélice. Etant donné que l'on a calculé que le pas de l'hélice est de

O

30 A, les bases distantes d'un tour de superhélice doivent être très proches.

La répétition à la résistance à la DNAase I pourrait refléter une protection simultanée due à cette proximité (voir figure 5c).

Figure 5c (LUTTER, 1 977 a)

Superhelical arrangement of the nucleosomd core DNA. The superhelical DNA containing 80 base pairs of DNA per turn is represented as a spiral for clarity.

Numbers refer to distances in bases from the 5' end ol one strand (they go in the opposite direction for the other strand). The arrows indicate the proposed dyad axis of the structure. The shaded areas, A and B. indicate the two diametrically opposed groupings of the sites of relatively low and medium cutting frequencies (see text).

WHITLOCK et collaborateurs ont montré que la sensibilité rela­

tive d'un site à l'intérieur du "core" du nucléosome, vis-à-vis des nu- cléases, est fonction de la nucléase employée. Ainsi, les sites compris entre 60 et 80_paires de bases par rapport à l'extrémité 5' sont relative­

ment insensibles dans les conditions .employées pour la DNAase I; dans les mêmes conditions, les mêmes sites sont facilement coupés par la DNAase n. Etant donné que dans les deux cas le DNA est coupé en frag­

ments qui ont toujours une longueur multiple de 1 0 bases, il est fort pro­

bable que les deux enzymes reconnaissent les mêmes propriétés répéti­

tives et que ce soit les mécanismes catalytiques qui soient responsables des différences trouvées au niveau des sensibilités de chaque site en par-

140 bp core

*■ High frequency DNAsel cutting O Low (or micrococcal pauses) O Medium

(32)

i

21

ticulier aux différents enzymes. L'emploi d'une seule nucléase pour digé­

rer les nucléosomes pourrait conduire à des prédictions fausses (WHITLOCK et al, 1 977).

1.3. 3. 3. L^jç A -AbAA _îIB£Iê 2.

Les analyses décrites ci-dessus conduisent, en accord avec les modèles physiques, à une explication de la modulation d'accès aux différents sites de coupure de quelques nucléases ; néanmoins, ils sont incapables d'ex­

pliquer pourquoi la séparation des différents sites de coupure est restreint à des multiples de 1 0 bases. Deux sortes d'explications conduisant à deux types de modèles différents, ont été proposées. Dans les deux cas, l'origine de cette répétition a un rapport avec le fait que dix paires de bases, consti­

tue un pas de la double hélice de WATSON et CRICK. Dans le première mo­

dèle (NOLL, 1 974 b), on suppose que la DNAase I peut seulement couper le DNA aux sites des expositions maximales des liaisons phosphodiester. Ces sites devraient se trouver sur la surface du nucléosome et se répéteraient chaque dix bases tout au long d'un brin de DNA (en reflétant de cette manière les pas de la double hélice). Si c'était le cas, les sites de coupures sur les deux brins complémentaires seraient alternés et se disposeraient l'un par rapport à l'autre d'une façon définie, caractéristique des dimensions de la double hélice, comportant des séparations de six et quatre nucléotides (LUTTER, 1 977 b ; SOLLNER-WEBB et FELSENFELD, 1 977). Dans le deuxième type de modèle "kinky hélix", des irrégularités apparaissent chaque dix paires de bases (CRICK et KLUG, 1 975 ; SOBELL et al, 1976), générant ainsi des sites de reconnaissance pour les nucléases. Si cette deuxième image était juste, les coupures générées par la DNAase I sur des brins complémentaires devraient soit coincider, soit être séparées par dix bases.

Dans la situation actuelle, il est possible à l'aide des DNAases de tester ces deux modèles. Des études ont été faites avec la DNAase I (LUTTER

1977 b ; SOLLNER-WEBB et FELSENFELD, 1 977), avec la DNAase II et avec la nucléase de micrococcus (SOLLNER-WEBB et al, 1978). Dans le cas de la DNAase I, une coupure sur un brin est séparée des deux coupures

(33)

les plus proches faites sur le brin complémentaire par 2 nucléotides (dans le sens 3* du brin complémentaire) et 8 nucléotides (dans le sens 5' du brin complémentaire). Dans le cas de la DNAase II, une coupure sur un brin est séparée des coupures faites sur les brins complémentaires par 4 et 6 nu­

cléotides par rapport aux extrémités 3' et 5' respectivement. La nucléase de micrococcus sépare les sites de coupures sur le brin complémentaire de 8 et 2 nucléotides par rapport aux extrémités 3’ et 5' respectivement. La détermination de ces paramètres a été faite en partant des fragments double brin générés par ces nucléases. Dans les conditions où l'on travaille, les nucléases employées ne font que des coupures sur un brin du DNA. Les fragments de DNA ainsi générés doivent contenir pourtant des morceaiix de DNA monocaténaires attachés à leurs extrémités 3' et 5' respectivement^.

Le nombre de nucléotides de ces fragments monocaténaires serait un reflet du nombre de nucléotides séparant les sites de coupure des brins complé­

mentaires.

La confirmation de l'existence de ces parties simple brin a été obtenue à l'aide d'iin dérivé partiel de la DNA polymérase I.

Ce dérivé appelé "large-fragment Pol I" (KORNBERG, 1 974) a été obtenu en traitant la DNA polymérase I de E. Coli avec une protéase. L'ac­

tivité DNA polymérase synthétique (5'—> 3') ainsi que l'activité exonuclé­

asique (3'—>5') de l'enzyme native sont maintenues, tandis que l'activité exonucléasique (5'—>3') est éliminée.

La figure 6 présente un schéma proposé par LUTTER (LUTTER, 1 977 b) afin de déterminer le nombre de nucléotides qui séparent les sites de coupures de la DNAase I sur les deux brins complémentaires.

Les résultats expérimentaux-confirment le schéma proposé : sur des gels dénaturânts, on peut repérer une nouvelle série de fragments après l'action de la DNAase I et de la DNA polymérase. Elle se comporte comme

+ Des hybrides DNA-DNA comportant moins de 1 0 paires de bases se dénaturent très facilement pendant la purification du DNA.

Figure

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Références

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