Le stress oxydant

La notion de stress oxydant fait appel à la notion de balance oxydative/antioxydative lorsque la cellule ne peut plus prendre en charge l’excès de production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ERONs), qui sont les sous-produits du métabolisme aérobie, à l’aide de ses défenses antioxydantes aboutissant à une accumulation de ERONs dans la cellule. En dépit de leurs efffets délétères, notamment sur l’oxydation des lipides membranaires, des protéines et de l’ADN, les EROs servent également de molécules signales pour réguler certains processus biologiques et physiologiques (Finkel 2011).

Un des mécanismes implique l’oxydation des résidus « cystéines » des protéines par le peroxyde d’hydrogène (Rhee, 2006). Les résidus « cystéines » existent sous la forme d’anions thiolates (Cys-S-) qui, à pH physiologique, sont plus sensibles à l’oxydation que leur forme protonée (Cys-SH) (Finkel, 2012). Ainsi, en condition de stress oxydant, le peroxyde d’hydrogène oxyde l’anion thiolate formant ainsi l’anion sulfénique (Cys-SOH) altérant alors la fonction de la protéine. Ce type de modification est réversible, notamment par l’intervention d’enzymes particulières telles les réductases thioredoxines et glutaredoxines. Il faut noter que l’oxydation sous la forme thiolate des cystéines se produit à des concentrations de peroxyde d’hydrogène proche du nM tandis que des concentrations plus élevées oxydent l’anion thiolate en espèces sulfinique (SO2) ou sulfonique (SO3). Ces dernières sont irréversibles avec pour conséquence, des dommages protéiques permanents.

Ainsi, les cellules possèdent des enzymes spécialement dédiées à la prévention de l’augmentation de la concentration du peroxyde d’hydrogène, à savoir les peroxyredoxines et les glutathione peroxydases.

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5.2.1. Les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote

Les espèces réactives oxygénées importantes dans les processus physiologiques incluent le radical superoxyde (O2^-), le radical hydroxyle (HO-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2), et l’acide hypochlorique. Parmi les espèces réactives de l’azote, on distingue le NO et le peroxyde nitrite. La réactivité de l’H2O2 est relativement faible mais il peut être converti sous une autre forme d’EROs comme le radical hydroxyle.

L’anion superoxyde est la première EROs à être produite et le précurseur de toutes les autres. La réduction de l’oxygène en anion superoxydeest réalisée à l’aide d’enzymes dites « pro-oxydantes ». La suite de la réaction fait intervenir des enzymes dites « antioxydantes », capables de détoxifier l’O2^-. Par la suite, cet anion sera d’abord converti en H2O2 par la « superoxyde dismutase » qui sera ensuite converti en H2O par la catalase ou la glutathion peroxydase (Figure 9).

Le système antioxydant intracellulaire est généralement suffisamment performant pour détoxifier la production endogène d’ERONs qui est continue. D’autre part, la production d’EROs s’insère également dans la médiation de nombreuses réponses cellulaires comme la régulation de la fonction mitochondriale, de l’expression de certaines protéines de stress et de la réponse immunitaire, de la relaxation musculaire et l’explosion respiratoire afin de tuer les micro-organismes infectieux (Chandel, Budinger, et Schumacker, 1996; Allen et Tresini, 2000; Bushell et al. 2002; Bedard et Krause, 2007).

Le peroxyde d’hydrogène est généré à partir de l’anion superoxyde produit par la mitochondrie et la NADPH oxydase (Lambeth 2004). Ce dernier est formé par la réduction d’un atome d’hydrogène et est rapidement converti par les superoxydes dismutases (SOD) 1 et 2 en H2O2. La SOD1 est localisée au niveau du cytosol et de l’espace intermembranaire tandis que la SOD2 est localisée au niveau de la matrice mitochondriale. Néanmoins, ces deux isoformes préviennent l’accumulation d’anions superoxydes qui peuvent endommager et inactiver les protéines (Fridovich 1997). Cependant, l’anion superoxyde n’est pas uniquement associé aux dommages cellulaires car il peut activer certaines voies de signalisation impliquées dans l’adaptation au stress oxydant (Chen, Azad, et Gibson 2009).

Un troisième type d’EROs, le radical hydroxyle oxyde les lipides membranaires, les protéines et l’ADN résultant en une instabilité du génome (Dizdaroglu et Jaruga, 2012). Les radicaux hydroxyles sont générés à partie de l’H2O2 en présene d’anion ferreux. Cependant, les cellules possèdent de nombreux mécanismes maintenant l’homéostasie du fer. Il est intéréssant

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de noter que les concentrations en H2O2 requises pour l’induction des voies de signalisation n’ont pas d’effet sur le ratio GSSG/GSH ou NADPH/NADP+ (Morgan, Sobotta, et Dick 2011). La compartimentalisation de la production des EROs au sein des cellules est déterminante des dommages cellulaires ou de la signalisation qui vont avoir lieu. Pour une signalisation redox effective, l’oxydation d’une protéine donnée par le peroxyde d’hydrogène doit être proche de la source d’H2O2. Par exemple, les cibles de l’H2O2 généré par la NADPH oxydase membranaire sont localisées au niveau de la membrane plasmique. La mitochondrie est reconnue pour se déplacer vers ses cibles permettant au peroxyde d’hydrogène produit par celle-ci d’actier des voies de signalisation (Al-Mehdi et al. 2012). De manière similaire, l’accumulation d’anion superoxyde dans la matrice mlitochondriale a des conséquences différentes de son accumulation dans le cytosol. Cela est dû aux protéines riches en fer et en suflures localisées dans la matrice mitochondriale. En effet, les souris déficientes en SOD2 ont un phénotype différent des souris déficientes en SOD1. Ainsi, c’est à la fois le type d’EROs et la concentration dans un environnement donné qui détermine la signalisation redox ou le stress oxydant.

Figure 9.Voies de production des EROs et de leur élimination. Reproduit de Dröge (2002).

5.2.2. Les enzymes responsables du stress oxydant

La production intracellulaire d’EROs dans les cellules endothéliales a lieu en condition physiologique et pathophysiologique. Dans l’endothélium, la productio d’EROs est sous le

NADPH oxydase Xanthine oxydase Hypoxanthine xanthine Superoxyde dismutase (SOD) Catalase GSH peroxydase GSH réductase Mitochondrie Xanthine Acide urique

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contrôle de quatre systèmes enzymatiques incluant les différents isoformes de la NADPH oxydase, la xanthine oxydoréductase, l’eNOS découplée et la chaîne de transport des électrons. Cependant d’autres sources comme l’acide arachidonique, les enzymes lipoxygénases et cyclooxygénases ou le cytochrome P450 (Cai, 2005) (Figure 10).

 La NADPH oxydase

Initialement identifiée dans les macrophages, dont la fonction première est la production d’anion superoxyde afin d’éliminer les micro-organismes, la NADPH oxydase a été identifiée dans les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses au sein desquelles elle produit l’anion superoxyde. Elle est formée de cinq sous-unités: deux sous-unités membranaires et trois sous-unités cytosoliques qui vont s’associer aux sous-unités membranaires quand elles seront activées (i.e. catécholamines, prostaglandines et angiotensine II) (Brandes et Kreuzer, 2005; Montezano et Touyz, 2012). Il existe cinq types de NOX: NOX1, NOX2, NOX3, NOX4 et NOX5. Les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses expriment les NOX1, NOX4 et NOX5. Néanmoins, les cellules musculaires lisses expriment également NOX2. La NADPH oxydase catalyse le transfert d’électrons à partir du cytosol à travers la membrane aboutissant

à la formation d’anion superoxyde (NOX1, NOXβ, NOX5) ou d’hydrogène péroxyde (NOX4).

De nombreuses études soulignent son implication dans les altérations de la fonction vasculaires. En effet, une augmentation de l’activité et de l’expression de la NOX ont été constatées dans le cas de l’obésité (Du et al. 2013; Lynch et al. 2013), de l’hypertension (Rajagopalan et al. 1996; Chen et al. 2012; Thengchaisri et al. 2015) ainsi que de stress inflammatoire (Frey et al. 2002; Park et al. 2006), et de diabète (Ebrahimian et al. 2006) et d’hyperglycémie (Balteau et al., 2011). Elle est considérée comme la source la plus importante d’anion superoxyde au niveau des vaisseaux.

 La xanthine oxydase

La xanthine oxydase métabolise l’hypoxanthine, la xanthine et le NADP pour former de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène. Son activité et son expression peuvent être stimulées par de nombreuses cytokines impliquées dans les réactions inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale (TNF-α), l’interféron-�, et les interleukines 1 et 6 (Berry et Hare, 2004).

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La production de ces EROs dépend de nombreux facteurs tels la tension en O2, le pH, et la concentration en purine. Les niveaux plasmatiques de xanthine oxydoréductase sont faibles dans le plasma mais en condition pathologique, ses niveaux augmentent et elle est convertie en la forme oxydase (Cantu-Medellin et Kelley, 2013). De nombreuses études ont montré son implication dans les pathologies telles l’hypertension (Suzuki et al. 1998; Swei et al. 1999), l’hypercholestérolémie (Ohara, Peterson, et Harrison 1993; White et al. 1996; Kushiyama et al. 2012) ainsi que le diabète (Butler et al. 2000; Desco et al. 2002; Erdei et al. 2006).

 La chaîne respiratoire mitochondriale

La chaine respiratoire mitochondriale est importante dans le maintien du niveau énergétique de la cellule car elle est capable de produire de l’ATP à partir de l’O2. La production d’ATP fait intervenir deux étapes: (1) l’oxydation de NADH et (β) la phosphorylation de l’ADP pour former de l’ATP. Le NADH est fourni par le métabolisme du glucose grâce la glycolyse et le cycle de Krebs. L’oxydation de NADH en NAD provoque un gradient de protons qui sont pompés dans la membrane intermitochondriale grâce aux complexes I, III et IV. Les électrons provenant de NADH sont transférés à divers complexes mitochondriaux aboutissant à la formation d’H2O.

La chaîne respiratoire mitochondriale est une des principales sources d’anion superoxyde dans la cellule (Liu, Fiskum, et Schubert, 2002). Même si la majorité de l’O2 entrant dans la chaine mitochondriale est transformée en H2O, une petite partie est transformée en O2^.-. La sortie d’anion superoxyde de la chaine respiratoire mitochondriale est un processus normal et participe au fonctionnement des processus physiologiques (Green, Brand, et Murphy, 2004). La fuite d’électrons est à l’origine de la production d’anion superoxyde à partir de l’oxygène mais, ne diffusant pas à travers la membrane, il est converti dans la mitochondrie par la SOD en peroxyde d’hydrogène et peut également réagir avec le NO pour former du peroxyde nitrite (Ramachandran et al. 2002). Le NO et l’hyperglycémie sont capables de réduire la respiration mitochondriale et d’augmenter la production d’anion superoxyde (Du et al. 2001; Brown et Borutaite, 2007).

 L’eNOS découplée

En l’absence de cofacteurs (L-arginine, BH4), l’eNOS deviant la source d’anion superoxyde au sein de l’endothélium (Vásquez-Vivar et al. 1998), devenant alors “découplée”. Ce découplage implique la conversion de l’eNOS en un monomère qui va produire de l’anion

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superoxyde à la place du NO. Le découplage de l’eNOS a été associée aux maladies cardiovasculaires qui sont en lien avec la dysfonction endothéliale telles l’athérosclérose, l’hypertension, l’hypercholestérolémie ou le diabète (Stroes et al. 1997; Higashi et al. 2002; Takaya et al. 2007).

Figure 10. Source des espèces réactives oxygénées dans l’endothélium. Les principales sources d’EROs sont la NADPH oxydase, l’eNOS découplée, la chaîne de transport des électrons et la xanthine oxydase. D’autres sources telles la lipoxygénase, la cyclooxygénase et le cytrochrome P450 contribuent à la production d’EROs dans l’endothélium. Reproduit de Bretón-Romero et Lamas (2014).

5.2.3. Cibles moléculaires du peroxyde d’hydrogène  Les lipides membranaires

Les acides gras polyinsaturés (PUFAs), présents au niveau des membranes plasmiques, sont des cibles importantes des ERONs (Halliwell et Chirico, 1993) (Figure 11).

NADPH oxydase Xanthine oxydase Mitochondrie eNOS découplée Lipoxygénase Cyclooxygénase Cytochrome P450

Domaine réductase Domaine oxydase

EROs EROs

85 Figure 11. Cibles intracellulaires des EROs. La respiration mitochondriale ainsi que des facteurs exogènes vont être à l’origine de la production d’EROs. Une fois produite, ces EROs vont oxyder les protéines, la membrane plasmique ou encore l’ADN. L’oxydation des protéines et de la membrane plasmique constitue le mécanisme prépondérant au sein de la cellule. L’oxydation des protéines aboutit à une perte de fonction des protéines ciblées résultant en une agrégation de protéines ou l’induction des mécanismes de l’apoptose.

La perte de la fonction de la membrane plasmique résulte en une perte de la viabilité cellulaire. Parmi toutes les EROs, l’anion superoxyde et le radical hydroxyle initient le processus autocatalytique appelé « peroxydation lipidique » résultant en la conversion d’un acide gras insaturé en hydroperoxyde lipidique, augmentant, ainsi, la fluidité membranaire, le flux sortant de solutés du cytosol et la perte des activités des protéines membranaires. Une peroxydation lipidique importante est corrélée avec la désintégration totale de l’intégrité de la membrane plasmique et la mort cellulaire.

Les produits des lipides oxydés peuvent initier d’autres dommages oxydatifs. Ainsi, le malondialdéhyde, un produit de l’oxydation des lipides, peut attaquer les acides aminés des protéines (Requena, Levine, et Stadtman, 2003) et induire la fragmentation de l’ADN (Wang et al. 2006)

 L’ADN

Il est admis que les principales EROs affectant l’ADN sont le radical hydroxyle et l’anion superoxyde aboutissant à une altération de la synthèse protéique.

ERO

Oxydation des protéines

Apoptose Perte de fonction des protéines Oxydation de l’ADN Peroxydation lipidique Respiration Agents chimiques Facteurs environnementaux Agrégation de protéines

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 Les protéines

Les protéines oxydées peuvent contribuer, directement, au stress oxydant en altérant directement la signalisation cellulaire, la structure cellulaire et les processus enzymatiques. De nombreux processus peuvent induire l’oxydation des protéines: les métaux, les EROs ainsi que les produits de la peroxydation lipidique

Le mécanisme d’oxydation par les métaux est le plus commun et aboutit à la formation de groupements carbonyles sur les protéines. Les EROs, quant à elles, induisent le clivage des ponts peptidiques (Garrison, 1989). Ces groupements carbonyles peuvent également être formés par des réactions secondaires avec des produits de la peroxydation (Stadtman et Levine 2000, 2003). Une des conséquences de la présence de groupements carbonyles est la réaction avec les acides aminés des résidus lysines aboutissant à la formation de liaison intra- et intermoléculaires et l’agrégation des protéines.

La sensibilité des protéines à l’oxydation dépend de la constante d’ionisation (pKa) et de l’environnement proche des résidus « cystéines ». Le pKa d’un groupement sulfure de nombreux résidus « cystéines » se situe vers 8.5 et, de ce fait, est ionisé à pH physiologique (Cys-SH) et rendu insensible à l’oxydation par le peroxyde d’hydrogène. Néanmoins, certaines protéines ont un pKa réduit, situées aux alentours de 5-6 et sont, en condition physiologique, sujettes à la réaction entre leur cystéine et le peroxyde d’hydrogène. Celui-ci est capable d’oxyder ces cystéines via la formation d’intermédiaires acides (S-OH), et de résidus disulfures (S-S) (Claiborne et al. 1993; Denu et Tanner, 1998).La formation de ces ponts disulfures peut se produire au sein d’une même protéine (pont intramoléculaire) (Lee et al. 2002)ou entre deux protéines (pont intermoléculaire)(van der Wijk, Overvoorde, et den Hertog, 2004)(Figure 12). Dès lors que la cystéine est oxydée, elle peut être réduite par des réductases telles les thiorédoxines et peroxyrédoxines pour les oxydations simples et par les glutarédoxines pour les ponts disulfures (Holmgren et al. 2005).

Ainsi, de nombreuses protéines impliquées dans des processus physiologiques sont sensibles à l’oxydation telles les phosphatases, les facteurs de transcription, les canaux ioniques, les enzymes antioxydantes et les protéines kinases (Thomas, Witting, et Drummond, 2008).

87 Figure 12. Modifications protéiques par le peroxyde d’hydrogène. La modification des protéines par le peroxyde d’hydrogène induit la dimérisation de deux cystéines adjacentes via la formation d’un intermédiaire instable, l’acide sulfénique. Les ponts disulfures peuvent se former entre deux cystéines de la même protéine (pont disulfure intramoléculaire), entre deux cystéines de protéines différentes (pont intermoléculaire) ou entre les groupements thiols et glutathions. Lorsque les concentrations intracellulaires de peroxyde d’hydrogène sont élevées, l’acide sulfénique est oxydé en acide sulfonique ou sulfinique. Reproduit de Bretón-Romero et Lamas

(2014).

5.2.4. Régulation du tonus vasculaire et de la relaxation vasculaire

Les effets des EROs sur le tonus vasculaire dépendent du type d’EROs, de leurs concentrations et du lit vasculaire concerné. L’anion superoxyde favorise la vasoconstriction grâce à sa réaction avec le monoxyde d’azote, réduisant ainsi sa biodisponibilité. Le peroxyde d’hydrogène, quant à lui, induit une vasodilatation dans les artères mésentériques (Gao et al. 2003), coronaires (Sato, Sakuma, et Gutterman, 2003) et pulmonaires (Burke et Wolin, 1987). D’autre part, la surexpression de la NADPH oxydase dans un modèle de souris transgéniques est associée à une vasodilatation accrue ainsi qu’une pression sanguine réduite (Ray et al. 2011). Il a été démontré que le peroxyde d’hydrogène était un facteur hyperpolarisant dérivé de

l’endothélium (Shimokawa et Matoba, 2004) mais également un activateur des canaux

potassiques impliqués dans la relaxation (Iida et Katusic, 2000). Néanmoins, il semble que ses effets vasorelaxants soient principalement dus à la production de NO. En effet, il a été montré que le peroxyde d’hydrogène activait l’eNOS grâce à l’activation de la voie PIγK/Akt (Cai et al. 2003) et ERK1/2 (Cai et al. 2003). En plus d’être un agent activateur de l’eNOS, il a été

Acide sulfonique

Acide sulfinique

Acide sulfénique Anion thiolate

Pont disulfure intermoléculaire

Pont disulfure intramoléculaire (homodimère)

Pont disulfure intramoléculaire (hétérodimère) S-O3-H S-O2-H S-OH S-S-OH S-S S S S-S S-S-G S-OH S-glutathionylation H2O2 H2O2 H2O2 GSH

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constaté que le peroxyde d’hydrogène était à l’origine d’une augmentation de l’expression de l’eNOS (Drummond et al. 2000).

5.3. Espèces réactives de l’oxygène et atténuation des fontions vasodilatatrices de