O estudo fenotípico exaustivo das subpopulações de CNK – CD56+ e CD56++ – e de LT TCRα β+ – CD4+ e CD8+ – no SP de indivíduos saudáveis e das alterações que estas células sofrem em resposta à activação celular
(Lima M e col., 2001-Art.17; Lima M e col., 2002-Art.21; Lima
M e col. 2003-Art.28) em conjunto com outros
estudos que foram entretanto publica- dos,359,360,361permitiram-nos, não só compreen-
der melhor a fisiopatologia das CNK e dos LT, como estabelecer critérios IF de (mono) clonalidade, criando as bases para identificar e poder caracterizar especificamente as CNK e os LT neoplásicos.
No pressuposto de que a identificação de perfis clono-fenotípicos das CNK e dos LT deve ter como termo comparativo o perfil IF das células linfóides normais, de tipo idêntico, no mesmo estadio maturativo, com a localização
359 Sedlmayr P e col (1996): Differential phenotypic properties of human peripheral blood CD56dim and CD56bright natural killer cell subpopulations. Int Arch Allergy Immunol 110: 308–13
360 Cooper MA e col (2001): Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56 (bright) subset. Blood 97: 3146–51 361 Jacobs R e col (2001): CD56bright cells differ in their KIR repertoire and cytotoxic features from CD56dim NK cells. Eur J Immunol 31: 3121-7
tecidular e no estadio de activação correspondentes, identificamos modelos que permitissem estabelecer a sequência das modificações IF que ocorrem, de uma forma paulatina no tempo, após activação das CNK e dos LT maturos do SP.
Assim, com base na caracterização fenotípica das CNK CD56+ e CD56++ do SP, no estudo das alterações IF das CNK CD56+ que preferencialmente expandem em condições em que é pressuposto existir activação das CNK “in vivo”, tal como nas infecções víricas agudas, nas infecções crónicas e nas neoplasias e na informação disponível na literatura sobre este assunto, criamos um MODELO DINÂMICO das alterações fenotípicas que ocorrem após activação das CNK, definindo uma FASE PRECOCE (estímulo agudo) e uma FASE TARDIA (estímulo crónico) de activação celular (Lima M e col., 2001 - Art.17; Lima M e col., 2002 - Art.21).
De uma forma muito sumária, podemos dizer que algumas modificações fenotípicas, tais como a expressão de HLA-DR e de CD45RO, o aumento de expressão de CD11a, CD11c e CD38 e a diminuição de expressão de CD11b, CD45RA e CD57 são alterações rela- tivamente PRECOCES após activação das CNK,
78 algumas das quais regridem (como a expressão de HLA-DR e a co-expressão de CD45RO), outras das quais tendem a acentuar-se (como a diminuição de CD11b), e outras ainda sofrem modificações opostas (como é o caso do CD38, cuja expressão, depois de um aumento transitório, diminui; do CD57 que, diminuindo numa fase inicial, vai aumentar numa fase tardia; e do CD11c que tem o comportamento oposto). Nesta fase precoce de activação, a expressão de CD7 não sofre grandes modi- ficações e as alterações de expressão de CD2 consistem sobretudo num aumento da fracção de CNK que expressam esta molécula.
Numa fase mais TARDIA do processo de activação celular, em que as CNK já expressam de forma débil CD11b e CD38, e em que na maioria dos casos já diminuiu significativa- mente a expressão de HLA-DR e de CD45RO na membrana, é evidente como a expressão de CD2 se torna homogénea, ao mesmo tempo que diminui e se torna heterogénea a expressão de CD7. Neste estadio de activação tardia, encontramos fundamentalmente CNK que expressam CD57 com intensidade relativamen- te forte e homogénea, e que mostram co- expressão variável, débil e heterogénea de CD11c.
Da mesma forma, criamos um MODELO DINÂMICO das modificações que presumível- mente ocorrem, de uma forma sequencial no tempo, no fenótipo dos LT, após a activação, definindo uma FASE PRECOCE (estímulo agudo) e uma FASE TARDIA (estímulo crónico) de activação celular (Lima M e col. 2003-Art.28).
Curiosamente, as modificações fenotípicas que ocorrem nos LT TCRα β+/CD8+ são muito
semelhantes às que ocorrem nos LT TCRα β+/CD4+; por sua vez, são também muito semelhantes às que descrevemos nas CNK, pondo uma vez mais em evidência o que estas células têm em comum do ponto de vista da sua ontogenia e das suas características funcionais.
Pode ser argumentado que a sequência que propomos carece de demonstração formal. Que seria, obviamente, interessante efectuar estudos seriados no tempo no mesmo indivíduo, a dife- rentes tempos após a intercorrência infecciosa, ou ainda obter informação complementar com o estudo IF sequencial dos LT e das CNK após estimulação “in vitro”.
Existem, apesar de tudo, alguns argumentos fortes a favor de que os modelos que propomos correspondem, de facto, às alterações que ocorrem “in vivo”: 1) As alterações fenotípicas das CNK são muito semelhantes às encon- tradas nos LT, sendo interessante constatar que, num e noutro caso, ocorre aumento de expressão de CD2 e diminuição de expressão de CD7 e que o aumento de expressão de HLA- DR, CD38 e CD45RO, bem como a expressão débil e heterogénea de CD11c acontecem em fases relativamente precoces de activação; da mesma forma que a expressão de CD57, ocorre em fases tardias; 2) as alterações propostas estão de acordo com os dados publicados na literatura, baseados em estudos de activação celular “in vitro”; 3) o estudo do IF dos LT de 31 doentes com mononucleose infecciosa separados em grupos conforme o tempo de- corrido após o início da sintomatologia (‹ 1 semana, 2-3 semanas e 4-10 semanas), apoia inteiramente o modelo sugerido para os LT (resultados não apresentados).
79 Por outro lado, os modelos propostos têm sido validados pela aplicação clínica diária, ao longo de pelo menos três anos, tendo ao longo deste tempo demonstrado uma grande utilidade na interpretação de resultados obtidos no estu- do de produtos biológicos potencialmente pato- lógicos e contribuído para a identificação, cara- cterização e, acima de tudo, compreensão da biologia da célula linfóide neoplásica. O teste- munho deste último aspecto é dado pelo facto do conhecimento do perfil fenotípico das CNK e dos LT normais e das alterações consequentes à activação celular subjacentes aos modelos propostos, nos terem permitido identificar numerosos casos de DLP-T e NK, entre os quais os dois tipos particulares de DLPC de LGL que descrevemos e que discutiremos mais adiante neste trabalho.
4.1.2. REPERTÓRIO DE FAMÍLIAS DE REGIÕES VARIÁVEIS DO RECEPTO R DA CÉLULA T NOS LINFÓCITOS T
O conhecimento do repertório TCR-Vβ dos LT do SP de indivíduos normais e da forma como ele se distribui nos LT TCRα β+/CD4+ e nos LT TCRα β+/CD8+ (Lima M e col. 2001 – Art.16) e os estudos que realizamos sobre o repertório TCR-Vβ em doentes com expansões persisten- tes de LGL-T (Lima M e col. 2001 – Art.16) foram de importância fundamental para a interpretação dos estudos do repertório TCR-Vβ em DLP-T. No trabalho em que procedemos ao estudo do repertório TCR-Vβ nos LT TCRα β+/CD8+ ou TCRα β+/CD4+ de doentes com aumento persistente de LGL-T TCRα β+/CD8+ ou TCRα β+/CD4+ no SP, respectivamente, veri- ficamos queestas compreendiam um espectro
vasto e contínuo de expansões de carácter policlonal, oligoclonal, ou monoclonal, que diferiam no tipo e número de famílias TCR-Vβ
expandidas, bem como na magnitude das expansões encontradas, sendo possível predizer o carácter monoclonal com base na magnitude da expansão TCR-Vβ.
De uma forma geral, este e outros estudos que efectuamos e que serão abordados de for- ma mais detalhada no decorrer deste trabalho, mostraram que nas expansões não mono- clonais de LT, o repertório TCR-Vβ tem uma distribuição semelhante ao do repertório TCR- Vβ dos LT TCRα β+ do SP normal ou apresen- ta pequenas expansões de uma, ou frequen- temente mais de uma, família TCR-Vβ que raramente excedem 40% do compartimento celular analisado, ao contrário do que acontece nas expansões monoclonais.
Considerando que uma expansão de LGL-T TCRα β+/CD4+ ou TCRα β+/CD8+forte é mono- clonal sempre que a expansão identificada excede 40% dos TCRα β+/CD4+ ou TCRα β+/ CD8+forte, obtivemos uma sensibilidade de 93% e um valor preditivo de 89%, para o diagnós- tico de monoclonalidade, com uma especifici- dade e um valor preditivo positivo de 80 e 87%, respectivamente. Aumentando o limite para 60%, tanto a especificidade como o valor preditivo positivo aumentaram para 100%, à custa de uma menor especificidade (81%) e valor preditivo negativo (78%).
Já o estudo equivalente para os LTγδ, isto é o estudo das famílias de regiões variáveis das cadeias γ e δ do TCR por CF, se mostrou, segundo a nossa experiência, de utilidade mais limitada para o diagnóstico de mono-
80 clonalidade das expansões de LT TCRγδ+
(resultados não apresentados). Deve-se esta limitação ao facto da maioria dos LT TCRγδ+ do SP de indivíduos adultos expressarem quase exclusivamente (> 90%) as famílias Vγ2 / Vδ9, presentes também numa proporção importante de DLPC-T TCRαβ+.
4.1.3. AVALIAÇÃO SIMULTÂNEA DO PERFIL IMUNOFENOTÍPICO E DO REPERTÓRIO DE FAMÍLIAS DE REGIÕES VARIÁVEIS DO RECEPTOR DA CÉLULA T