O desenvolvimento de pesquisas com produtos naturais definidos como nutracêuticos têm sido implementados com objetivo de implantar suporte terapêutico considerando eficácia e segurança. Nesse contexto, a utilização de alimentos com propriedades capazes de atuar de maneira benéfica em processos metabólicos e celulares, responsáveis pelo estabelecimento de doenças crônicas, são alternativas interessantes, inclusive, para minimizar custos com a saúde (215-217).
Alimentos como vegetais, frutas, sementes, chocolate, vinho, chás, têm sido objetos de estudo devido as suas propriedades antioxidantes, antiproliferativas, anti-inflamatórias e neuroprotetoras na eventual possibilidade de seu uso como suporte ao tratamento de doenças como câncer, obesidade, doenças cardíacas, hepáticas, renais, degenerativas e autoimunes, as quais, estão fortemente associadas ao estresse oxidativo (188, 190). Tais alimentos, têm sido descritos como “alimentos funcionais”, termo que surgiu na década de 80, e que caracteriza determinados alimentos por conterem em sua composição fibras, proteínas, vitaminas, ácidos graxos e polifenóis, os quais, conferem a estes alimentos, além da função nutricional, capacidade de prevenir ou modular o risco dessas doenças. O maracujá doce é um fruto de grande cultivo e consumo comercial no Brasil, sendo classificado taxonomicamente como pertencente à espécie Passiflora alata Curtis (179).
Em trabalho prévio do grupo (195), realizamos a extração em solvente aquoso de componentes fenólicos, provenientes das folhas de P. alata, sob temperatura e pressão controladas. Este processo permitiu a caracterização de compostos fenólicos majoritários como rutina, epicatequina, catequina, isoorientina, vitexina, isovitexina e isoorientina. Além disso, demonstramos efeito antioxidante do extrato aquoso administrados a camundongos NOD, observados pela diminuição da apoptose e da frequência de células inflamatórias nas ilhotas pancreáticas como ação antiestresse oxidativo visto na insulite destes animais.
Adicionalmente (32), além dos efeitos observados in vivo na redução da incidência do diabetes nestes animais, demonstramos o efeito do extrato aquoso in vitro inibindo a proliferação de linfócitos de camundongos NOD, estimulados com o mitógeno concanavalina A (ConA), indicando efeito imunomodulador dos compostos fenólicos presentes nas folhas de P.alata.
Após a consolidação desses resultados provenientes de estudos in vivo, focamos na investigação dos efeitos do extrato aquoso de P. alata e dos polifenóis sobre as células envolvidas no processo inflamatório do DM1. Para isso, no presente trabalho utilizamos modelo experimental de cultivo celular de linfócitos ativados provenientes de camundongos NOD ShiLt/J diabéticos e submetidos a cultura mista com células da linhagem MIN6 na presença de IL-2. Neste modelo, testamos os efeitos anti/pró-oxidantes do extrato aquoso na forma liofilizada, nas populações de linfócitos que foram reativadas in vitro após interação com antígenos provenientes das células MIN6.
Previamente demonstrarmos o efeito antioxidante do extrato aquoso de P. alata in vivo, verificado pela diminuição do estresse oxidativo nas ilhotas pancreáticas, sugerindo assim, efeito protetivo sobre o pâncreas, principalmente proveniente dos polifenóis contidos no extrato (195). Polifenóis podem modular especificamente processos inflamatórios, agindo diretamente sobre proteínas envolvidas na sinalização e oxidação em células do sistema imunológico tais como, macrófagos, NK, linfócitos B e T (198). Nesse sentido, buscamos subsidiar o entendimento dos efeitos do P. alata in vitro e avaliamos o efeito do EALFPA sobre as células do infiltrado inflamatório, mais precisamente os linfócitos, além de avaliar alguns dos mecanismos indutores de estresse oxidativo gerado nessas células.
Ambas EROs e ERNs estão caracterizadas como produtos secundários do metabolismo celular aeróbio, e sob condições fisiológicas, estão envolvidas principalmente na produção de energia, sinalização celular, apoptose, fagocitose e regulação do crescimento celular. No entanto, o excesso em sua geração apresenta efeitos prejudiciais às células como agressão às proteínas dos tecidos, às enzimas, aos carboidratos e DNA, estando também envolvida na peroxidação dos lipídeos de membrana (85). No DM1, a hiperglicemia prolongada é um dos fatores mais importantes, responsável pela indução ao estresse oxidativo.
O desenvolvimento das alterações teciduais e complicações associadas ao DM1 estão relacionadas a disfunções metabólicas, as quais, estão fortemente associadas a inibição de vias de sinalização celular ativadas pela insulina. Nesse sentido, a geração do estresse oxidativo torna-se favorecida principalmente pela resistência à insulina e ao aumento na produção de radicais livres, em consequência da hiperglicemia prolongada (125). Em um ambiente de estresse oxidativo, o aumento na síntese de ERNs é consequência da reação de oxido-redução entre o O2 e o NO,
levando a geração de produtos intermediários danosos, como por exemplo, o peroxinitrito (ONOO-), importante espécie reativa não radicalar envolvida na
progressão de danos ao DNA e indução de peroxidação lipídica.
O NO é reconhecido como um produto multifuncional, com propriedades biológicas essenciais, agindo principalmente como mensageiro intracelular, mediando diversos processos fisiológicos e patológicos. Além de suas funções vasodilatadora, neurotransmissora e agente tóxico, exerce importante papel na imunidade por meio da síntese enzimática em células do sistema imunológico por meio da expressão da NOS-2, estando associada principalmente a liberação de citocinas inflamatórias e atividade microbicida (105). Desta forma, quantificar os níveis de síntese e liberação de NO em sistemas biológicos, é ferramenta útil na compreensão de mecanismos celulares imunológicos modulados pelo NO, como o estresse oxidativo e a inibição da capacidade antioxidante, observados em doenças como o DM1.
Alguns métodos de quantificação do NO ou seus subprodutos estão disponíveis, tais como, ensaio de quimioluminescência em culturas de células endoteliais (94), ensaios espectrofotométricos (98), espectrometria de massa por cromatografia gasosa (218), no entanto, essas técnicas são na maioria das vezes altamente dispendiosas, exigem instrumentação específica e qualificação técnica capacitada. Além disso, apresentam limitações como baixa sensibilidade e especificidade por não detectar a produção contínua em tempo real de NO. Uma abordagem alternativa simplificada e facilmente acessível para a detecção de baixos níveis de NO em células vivas, é o uso de sondas fluorescentes.
As sondas diaminofluoresceínas (DAFs) sensíveis ao NO foram desenvolvidas por Kojima et al (1998) (219) utilizando células de músculo liso da aorta de ratos. A sonda inicialmente desenvolvida foi a 4,5-diaminofluoresceína (DAF-2), a qual, quantifica NO extracelular através da reação com produtos da oxidação de NO gerando triazolofluoresceína (DAF-2T) com intensidade verde fluorescente elevada. Nakatsubo et al (1998) (220) utilizaram os indicadores de fluorescência DAF para detecção de NO em cultura de células de linhagem de macrófagos ativados e células endoteliais e os comparou com o ensaio de Griess, observando a vantagem do método com relação a detecção de menores concentrações de NO em menor tempo de ensaio. A forma 4-amino-5-metilamino- 2’,7’- difluorofluoresceína diacetato (DAF- FM D), é uma forma derivada da DAF-2, porém, com a vantagem de ser mais sensível e fotoestável. A DAF-FM é uma forma permeável à membrana celular, onde o
grupamento acetil de sua estrutura é clivado por esterases intracelulares, a qual, após reagir com o NO ou seus produtos, produz um rendimento quântico elevado com excitação/emissão máxima de 495/515 nm, podendo ser quantificado por qualquer instrumento capaz de detectar fluoresceína, incluindo citometria de fluxo, microscópios de fluorescência, leitores de microplacas fluorescentes e fluorômetros.
Assim, para avaliação dos efeitos in vitro utilizamos culturas mistas contendo células MIN6 e linfócitos T obtidos de camundongos NOD diabéticos e submetidas ao tratamento com o EALFPA ou com os polifenóis catequina e rutina. No tratamento das culturas mistas, diferentes concentrações de EALFPA forma utilizadas (50, 200 e 500 g/mL), estabelecidas previamente a partir de ensaios de avaliação da concentração correspondente ao EC50 (concentração referente à inibição em aproximadamente 50% da proliferação de linfócitos em cultura mista com células MIN6). Em contrapartida, com relação aos polifenóis obtidos comercialmente, utilizamos apenas a concentração definida correspondente ao EC50, sendo 50 M de catequina e 300 M de rutina (208).
Para a análise da presença e atividade de óxido nítrico nos linfócitos considerados ativos e viáveis, identificamos primeiramente as subpopulações CD4+ e
CD8+ através de marcação com anticorpos de superfície específicos. Posteriormente,
dentro das subpopulações definidas, quantificamos a frequência de células positivas para o óxido nítrico através da sonda DAF-FM.
A análise dos nossos resultados monstram que em linfócitos TCD4+ ativos
e viáveis, submetidosao tratamento com EALFPA nas concentrações de 200 e 500 g/mL, e nos tratamentos com catequina e rutina, houve maior quantificação significativa da presença de óxido nítrico, quando comparados com o controle negativo sem nenhum tratamento prévio. Já na população de linfócitos TCD8+,
embora em menor proporção, também observamos um efeito significativo de aumento na quantificação da presença de NO, referente aos tratamentos com catequina e rutina. No tocante ao tratamento com o EALFPA, observamos que seu efeito nessas células foi maior quando na concentração de 500 g/mL, podendo possivelmente sugerir maior sinergismo da ação de todos os polifenóis presentes no extrato.
Para validação da marcação fluorescente da sonda, utilizamos como controle positivo, culturas tratadas com nitroprussiato de sódio (SNP). O SNP é um sal sódico solúvel em água, contendo em sua estrutura Fe+2 e cinco ânions cianeto.
No organismo, ele reage principalmente com grupos sulfidrila em eritrócitos, albumina e outras proteínas, e sua principal característica de reação é agir como uma fonte liberadora de NO. A partir dos primeiros estudos sobre o seu uso em pacientes hipertensos, o SNP é conhecido e bastante utilizado como um nitrovasodilatador para controle da hipertensão sistêmica, e em cirurgias cardíacas e vasculares. Embora seu mecanismo reacional ainda não esteja totalmente esclarecido, sabe-se que o NO gerado a partir do SNP, estimula a guanil ciclase produzir GMPc, sequestrando cálcio e inibindo a contração celular (221). Sasaki et al (1996) (222) relataram efeito antitrombótico do SNP com consequente aumento no diâmetro dos vasos e na velocidade média dos eritrócitos nas arteríolas cerebrais de ratos, podendo ser benéfico contra o infarto cerebral. Xian et al (2013) (223) avaliaram o efeito de vários moduladores sobre a produção de NO, entre os principais, os inibidores NG- monometil L-arginina (L-NMMA) e 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazonina-1- oxil-3-óxido) (C-PTIO), e indutores da síntese de NO, como o SNP, demonstrando a utilização da sonda DAF-FM D para detecção e quantificação do nível NO intracelular por meio da citometria de fluxo em três diferentes subtipos de hemócitos de camarão. A maioria dos estudos sobre o uso de polifenóis na indução da síntese e atividade do NO, estão relacionados a sua capacidade de indução do aumento da expressão da atividade de NOS em células endoteliais exercendo um efeito vaso- protetor em doenças cardiovasculares (224-226). Com relação ao seu efeito em processos inflamatórios, a abordagem mais amplamente estudada, tem seu foco voltado para o entendimento da sua participação no desenvolvimento de mecanismos efetores e reguladores da resposta imunológica (227, 228).
Diversos estudos, tanto in vivo como in vitro, ressaltam as propriedades antioxidantes dos polifenóis que atuam de maneira benéfica em diversas doenças cuja fisiopatologia inclui o estresse oxidativo, exercendo efeitos neuro e vaso-protetor, antiproliferativos, e antioxidantes, como os demonstrados em nossos trabalhos iniciais (23, 195). Os mecanismos pelas quais os polifenóis atuam regulando o estresse oxidativo está diretamente relacionado a sua capacidade de sequestrar radicais livres, ativar enzimas antioxidantes e inibir enzimas oxidantes, quelar íons metálicos e modular transdução de sinais celulares (192). Em contrapartida, sob certas circunstâncias, e fatores como concentração e mecanismo de interação com outras moléculas, os polifenóis também podem promover a oxidação de alguns componentes
celulares, tais como proteínas e lipídios, e exercer dessa maneira, um efeito pró- oxidante.
Um dos principais efeitos pró oxidantes associados a síntese de NO, é o efeito antiproliferativo. Hoffman et al (1990) (229) mostraram que NO inibe a proliferação de linfócitos T, demonstrando a atividade de NOS na proliferação de esplenócitos de ratos estimulados por fitohemaglutinina e também na resposta linfocitária, bem como na supressão da atividade de NOS através de L-NMMA em culturas. Em estudo recente, Hossain et al (2018) (230) fornecem evidências de que o tratamento intraperitoneal de ratos espontaneamente hipertensos com o SNP aumentou significativamente os níveis intracelulares de NO em células musculares lisas vasculares levando, por sua vez, a diminuição na proliferação dessas células modulando a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular.
A disfunção endotelial está entre as principais complicações caracterizadas no DM a qual está fortemente associada com a ativação de vias da oxidação da glicose promovida pelo estresse oxidativo gerado a partir da hiperglicemia crônica. Tal condição leva ao aumento da formação de EROs mitocondrial como o superóxido (O2).
Como relatado anteriormente, o ONOO- é um produto proveniente da reação de oxi-
redução de O2 e NO. Seu potente efeito citotóxico ocorre devido ao seu ataque direto
ao DNA, ativação da enzima nuclear PARP e consequente inibição da GAPDH, envolvida na unificação das principais vias de oxidação da glicose, promovendo assim a morte celular. Quan et al (2017) (231) demonstrou o efeito citotóxico dose- dependente induzido por SNP e a geração de ONOO- e NO, detectado através da
sonda DAF-FM em culturas de células de linhagem humana de carcinoma hepático (HepG2 e Hep3B). O tratamento induziu o dano ao potencial de membrana mitocondrial levando a apoptose.
Evidências relatam também, o importante papel das citocinas no estímulo à diferenciação e maturação de linfócitos efetores (12). Linfócitos TCD4+ e TCD8+
correspondem a maioria dos linfócitos totais. A população CD4+ é classificada em
subtipos celulares funcionais conhecidos como T-auxiliar (Th) e podem ser diferenciadas com relação ao seu perfil de secreção de citocina. Th1 está associada a eventos de autoimunidade e produzem citocinas com IL-2, TNF e IFN-. Th2 está associada a eventos do sistema imune humoral, e expressam com maior frequência citocinas como IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. No desenvolvimento do DM1, o padrão de dano às células pancreáticas ocorre principalmente pela ação de tais citocinas, as
quais, estão presentes no estabelecimento da insulite (12, 13). IFN-, TNF- e IL-1 estão envolvidas no aumento da presença de NOS em ilhotas, resultando no aumento na síntese de NO em macrófagos (232).
Nossos resultados de aumento da atividade de NO em linfócitos ativados, corroboram com os dados do trabalho anterior do nosso grupo (208), no qual, constatamos que o tratamento com EALFPA, catequina e rutina, foram capazes de induzir apoptose tardia/necrose nesses linfócitos ativados mantidos em cultura mista com células MIN6, possivelmente sendo o motivo da diminuição da secreção de citocinas como TNF-α e INF- em TCD4+ e TCD8+. Em contrapartida, Jacob et al
(1990) (233) demonstraram o efeito in vivo antidiabetogênico de injeções de TNF e IL- 1 em camundongos NOD. Mills (1991) (234) propõe que os efeitos in vivo antiabetogênicos observados nesses animais, são resultados da ação de tais citocinas na ativação de macrófagos e consequente formação de NO, a qual, suprime a proliferação de linfócitos in vitro. Entretanto, uma vez que em doenças autoimunes o principal dano fisiopatológico no organismo ocorre por meio de uma reação inflamatória exacerbada de ativação de células imunes, a ação do NO sobre essas células, sugere, portanto, um efeito protetivo nessas doenças, devido ao seu efeito citotóxico de inativação e morte celular. Devido ao seu papel importante no desencadeamento da insulite observada nas ilhotas pancreáticas (233), o uso de recursos antiproliferativos que atuem sobre os linfócitos TCD4+ e TCD8+ podem,
consequentemente, preservar a funcionalidade das células .
Ainda, sobre o dano oxidativo gerado nos linfócitos, investigamos também o efeito do tratamento em relação ao comprometimento da integridade das membranas celulares. EROs e ERNs são responsáveis pela oxidação de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), por meio de diversas reações em cadeia, denominadas peroxidação lipídica, responsáveis pelo comprometimento da integridade e fluidez das membranas, favorecendo a perda da resistência elétrica e consequentemente a perda da permeabilidade seletiva, acarretando na liberação de conteúdo das organelas (152).
Com relação à peroxidação lipídica nos linfócitos, a análise dos nossos resultados mostrou que apenas o tratamento com o EALFPA na concentração de 500 g/mL aumentou significativamente este processo na população total de linfócitos. Catequina e rutina, embora não tenham promovido diferença significativa com relação
ao controle, demonstram uma tendência a diminuição, divergindo do resultado da análise de TBARS, que será discutida mais adiante.
O aumento da peroxidação lipídica em nosso modelo de investigação pode estar associada ao aumento do estresse oxidativo pela ação do NO nos linfócitos. A peroxidação lipídica no diabetes geralmente ocorre por meio de um processo não enzimático. Na mitocôndria, a transferência de elétrons leva a redução do oxigênio e a formação dos radicais O2 e H2O2. Esses radicais, associados a íos de Fe+2 levam a
formação de radicais OH-, via reação Fenton, que por sua vez, removem um átomo
de hidrogênio do grupo metileno (CH2) iniciando as reações em cadeia da peroxidação
lipídica (235).
Radicais livres como o NO podem inibir ou promover a peroxidação lipídica. Como inibidor, o NO age sequestrando radicais lipídicos propagadores (peroxila), além de inibir enzimas peroxidases iniciadoras. Como agente indutor, promove a partir da oxidação de O2, a formação de ONOO-, importante radical iniciador das reações
em cadeia da peroxidação lipídica (236).
A maioria dos estudos in vivo mostram que flavonoides induzem a diminuição da peroxidação lipídica em algumas doenças associadas ao estresse oxidativo. Akomolafe et al (2015) (237) investigaram o efeito do extrato aquoso das folhas de Tetracarpidium conophorum em genitais de ratos. A caracterização da planta por HPLC revelou alguns dos principais polifenóis constituintes, entre eles, ácido gálico, ácido cafeico, catequina, rutina, quercetina, entre outros. O estudo demonstrou efeito dose-dependente na diminuição significativa da peroxidação lipídica em homogenatos de tecido peniano estimulados com Fe+2 e aumento na capacidade
antioxidante pelo sequestro do radical ABTS.Fremont et al (1998) (197) demonstrou o efeito da dieta rica em catequina e quercetina na diminuição da oxidação de lipoproteínas VLDL e LDL e diminuição da peroxidação lipídica em ratos Wistar alimentados com dietas ricas em PUFAs. Quanto aos estudos in vitro, os efeitos pró- oxidantes dos flavonoides são, em sua maioria, voltados para estudos do câncer e seu efeito citotóxico e antiproliferativo nas células cancerígenas (238).
O aumento do estresse oxidativo é decorrente do aumento na formação de radicais livres, os quais, ao agirem sobre componentes celulares vitais, podem promover danos, e consequentemente aumentar o risco de desenvolvimento de doenças cardíacas e degenerativas por exemplo (80). Em nosso modelo de estudo, foi possível demonstrar que os flavonoides presentes no EALFPA atuam de maneira
sinérgica na indução de dano oxidativo aos linfócitos TCD4+ e TCD8+, promovido pelo
aumento de NO e consequente aumento na peroxidação lipídica nestas células, as quais estão diretamente relacionadas como desenvolvimento do processo inflamatório encontrado nas ilhotas pancreáticas.
Em oposição ao efeito pró-oxidativo observado, acarretando no dano celular observado nas populações de linfócitos, observamos um efeito antioxidante do EALFPA e dos polifenóis ao analisarmos os sobrenadantes das culturas mistas pelas técnicas de FRAP e ABTS. Há diversas metodologias descritas na literatura no tocante à avaliação da capacidade antioxidante de substâncias puras como, extratos de alimentos e amostras biológicas, embora, tal avaliação seja mais comum no primeiro caso. Tais metodologias são conhecidas como ensaios de Capacidade Antioxidante Total (CAOT) e, de modo geral, são quantificadas a partir de reações químicas, as quais, geram um radical que reage com uma molécula alvo produzindo uma mudança que pode ser mensurada por cor, fluorescência ou quimioluminescência ao longo de um intervalo de tempo detectável (83, 239).
De modo geral, a atividade de antioxidantes naturais está relacionada à sua estrutura química, e também, ao seu mecanismo de ação. Eles podem agir tanto como antioxidantes primários, ou seja, removendo os radicais por atuarem como doadores de hidrogênio; ou antioxidantes secundários, podendo reduzir a decomposição de peróxidos e hidroperóxidos, ou quelar íons metálicos, importantes catalisadores das reações de peroxidação lipídica. Devido a interferências como complexidade dos compostos, estabilidade da amostra, coloração e tempo de detecção, torna-se útil e necessário a utilização de mais de um método para obtenção de resultados que