cultura mista com células MIN6
Os linfócitos que foram mantidos em cultura mista com as células MIN6 durante 96 hs, e submetidos aos tratamentos com as concentrações do EALFPA e os polifenóis catequina e rutina (concentração correspondente ao EC50) foram Figura 11: frequência cumulativa sobre a incidência do diabetes nos camundongos NOD ShiLt/J. Observa-se que 80,7% (25/31) dos animais ficaram diabéticos ao longo das 30 semanas de vida.
submetidos à marcação com a sonda DAF-FM diacetato (4-amino-5-methylamino- 2’,7’-difluorofluorescein diacetate) para avaliação da presença de óxido nítrico nas subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ viáveis marcados previamente com a
sonda Zombie NIR™ (Biolegend).
Com relação a subpopulação T CD4+, nos grupos tratados, houve aumento
significativo na detecção de NO (células DAF+) nas concentrações de 200 e 500 g/mL (p<0,0001) do EALFPA e nos grupos catequina e rutina (p<0,05), em comparação ao grupo controle não tratado (C neg). Houve diferenças significativas também entre as diferentes concentrações nos grupos tratados com EALFPA, sendo que as concentrações de 200 e 500 g/mL (p<0,01) apresentaram uma maior frequência de células positivas para detecção de NO em relação a concentração de 50 g/mL.
Com relação a subpopulação T CD8+, nos grupos tratados, houve aumento
significativo na frequência de células positivas para detecção de NO (células DAF+) nas concentrações de 200 (p<0,001) e 500 g/mL (p<0,0001) do EALFPA, e nos grupos tratados com catequina (p<0,001) e rutina (p<0,01) em comparação ao grupo controle não tratado (C neg). Verificamos aumento significativo também entre as diferentes concentrações nos grupos tratados com EALFPA, sendo a concentração de 500 g/mL (p<0,01) a de maior detecção em relação às concentrações de 50 e 200 g/mL (p<0,05).
Os dados acima descritos, estão detalhados no quadro 3 (pág. 77) e demonstrados nas figuras 12 (pág. 78) e 13 (pág. 79) (T CD4+ e T CD8+ EALFPA,
respectivamente); 14 (pág. 80) e 15 (pág. 81) (T CD4+ e T CD8+ catequina,
Quadro 3: Frequência de linfócitos T CD4+ e T CD8+ DAF+ viáveis nos diferentes
grupos controle não tratados (C neg) e tratados em cultura mista com as células MIN6 (média e erro padrão da média).
Grupos % T CD4+ DAF+ (±EPM) % T CD8+ DAF+ (±EPM)
C pos 48,18±5,81 33,08±5,16 C neg 19,10±4,09 3,13±0,53 EALFPA 50 g/mL 31,81±6,43 7,37±1,15 EALFPA 200 g/mL 71,73±3,86 32,94±2,37 EALFPA 500 g/mL 71,77±4,24 41,19±4,49 Catequina 50 M 31,51±4,69 8,63±1,38 Rutina 300 M 32,47±4,44 5,98±0,72
Figura 12: A). Gráficos (dot plots) representativos da análise em citometria de fluxo da frequência de linfócitos T CD4+DAF+ viáveis em cultura mista com células MIN6 nos
diferentes grupos tratados com EALFPA. B). As barras representam a média e erro padrão da média (±EPM) da frequência (%) de linfócitos T CD4+DAF+ nos diferentes grupos
tratados com EALFPA. Como controle positivo do ensaio, foram utilizados linfócitos em cultura mista com células MIN6 estimulados com o doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) na concentração de 0,2 M. A diferença estatística entre os grupos, obtida em teste ANOVA com pós-teste de múltiplas comparações de Dunn’s, é representada pelo símbolo (*). Comparados apenas com C neg (MIN6 e Linf), p**<0,01; ****p<0,0001; n=6.
Figura 13: A). Gráficos (dot plots) representativos da análise em citometria de fluxo da frequência de linfócitos T CD8+DAF+ viáveis em cultura mista com células MIN6 nos diferentes
grupos tratados com EALFPA. B). As barras representam a média e erro padrão da média (±EPM) da frequência (%) de linfócitos T CD8+DAF+ nos diferentes grupos tratados com
EALFPA. Como controle positivo do ensaio, foram utilizados linfócitos em cultura mista com células MIN6 estimulados com o doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) na concentração de 0,2 M. A diferença estatística entre os grupos, obtida em teste ANOVA com pós-teste de múltiplas comparações de Dunn’s, é representada pelo símbolo (*). Comparados apenas com C neg (MIN6 e Linf), p*<0,05; p**<0,01; p***<0,001; ****p<0,0001; n=6.
Figura 14: A). Gráficos (dot plots) representativos da análise em citometria de fluxo da frequência de linfócitos T CD4+DAF+ viáveis em cultura mista com
células MIN6 nos diferentes grupos tratados com catequina. B). As barras representam a média e erro padrão da média (±EPM) da frequência (%) de linfócitos T CD4+DAF+ nos diferentes grupos tratados com catequina. Como
controle positivo do ensaio, foram utilizados linfócitos em cultura mista com células MIN6 estimulados com o doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) na concentração de 0,2 M. A diferença estatística entre os grupos, obtida no teste de Mann-Whitney, é representada pelo símbolo (*). Comparados apenas com C neg (MIN6 e Linf), p*<0,05; n=6
Figura 15: A). Gráficos (dot plots) representativos da análise em citometria de fluxo da frequência de linfócitos T CD8+DAF+ viáveis em cultura mista com
células MIN6 nos diferentes grupos tratados com catequina. B). As barras representam a média e erro padrão da média (±EPM) da frequência (%) de linfócitos T CD8+DAF+ nos diferentes grupos tratados com catequina. Como
controle positivo do ensaio, foram utilizados linfócitos em cultura mista com células MIN6 estimulados com o doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) na concentração de 0,2 M. A diferença estatística entre os grupos, obtida no teste de Mann-Whitney, é representada pelo símbolo (*). Comparados apenas com C neg (MIN6 e Linf), p***<0,001; n=6
Figura 16: A). Gráficos (dot plots) representativos da análise em citometria de fluxo da frequência de linfócitos T CD4+DAF+ viáveis em cultura mista com células MIN6
nos diferentes grupos tratados com catequina. B). As barras representam a média e erro padrão da média (±EPM) da frequência (%) de linfócitos T CD4+DAF+ nos
diferentes grupos tratados com catequina. Como controle positivo do ensaio, foram utilizados linfócitos em cultura mista com células MIN6 estimulados com o doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) na concentração de 0,2 M. A diferença estatística entre os grupos, obtida no teste de Mann-Whitney, é representada pelo símbolo (*). Comparados apenas com C neg (MIN6 e Linf), p*<0,05; n=6.
Figura 17: A). Gráficos (dot plots) representativos da análise em citometria de fluxo da frequência de linfócitos T CD8+DAF+ viáveis em cultura mista
com células MIN6 nos diferentes grupos tratados com catequina. B). As barras representam a média e erro padrão da média (±EPM) da frequência (%) de linfócitos T CD8+DAF+ nos diferentes grupos tratados com
catequina. Como controle positivo do ensaio, foram utilizados linfócitos em cultura mista com células MIN6 estimulados com o doador de óxido nítrico nitroprussiato de sódio (SNP) na concentração de 0,2 M. A diferença estatística entre os grupos, obtida no teste de Mann-Whitney, é representada pelo símbolo (*). Comparados apenas com C neg (MIN6 e Linf), p**<0,01; n=6.
5.3. Efeito do EALFPA, catequina e rutina na indução a peroxidação