Application à HU

1.1. Optimisation de la tension d’accélération

L’étude du complexe HU est le sujet d’une collaboration avec Bertrand Castaing, responsable de l’équipe « Réparation de l’ADN : approches structurales et fonctionnelles », au Centre de Biophysique Moléculaire d’Orléans.

HU est une protéine présente à l’état de dimère en conditions physiologiques en solution de masse moyenne monomérique Mmoy(HUĮ) = 9535.0 Da et dimérique Mmoy(HUĮ2) = 19070 Da. Vis et ses collaborateurs ont montré que pour observer HU sous forme dimérique, il est indispensable d’optimiser la pression à l’interface et la tension d’accélération (175).

Avant d’étudier l’effet de la variation de la tension d’accélération sur la préservation des interactions non-covalentes maintenant le dimère, des spectres du dimère HUĮ2 dénaturé et du dimère non-dénaturé ont été obtenus avec le mode assisté d’EsquireControl (Figure 50). Le mode assisté permet d’utiliser la fonction « Smart Parameter Setting », qui optimise les voltages appliqués sur la cap exit, l’octopole 2 DC et l’octopole RF en fonction du rapport m/z ciblé. Les voltages appliqués sur le skimmer, l’octopole 1 DC, les lentilles 1 et 2, eux, restent constants et sont respectivement de 40, 8, - 5 et - 60 V. La fonction « Smart Parameter Setting » permet également d’ajuster l’optimisation en fonction de la stabilité du composé.

Plus la stabilité est faible et plus le voltage de la cap exit est diminué.

Figure 50: Spectres ESI-IT du dimère HUĮ2 a) en conditions dénaturantes à 0.5 µM dans WAFA et b) en conditions natives à 10 µM dans NH4OAc 50 mM pH 6.5.

600 800 1000 1200 1400 1600

m/z

7+ 6+

8+

9+

10+

11+

12+

13+

14+

15+

a) HUĮ₂en conditions dénaturantes

1600 1800 2000 2200 2400

m/z 6+

10+/5+

6+

8+/4+

/

/ b) HUĮ₂en conditions natives

M = 9536.5 Da

Intensité (a.u.)

M = 9536.1 Da M = 19073.1 Da

En conditions dénaturantes, seul le monomère est visible, sa distribution d’états de charge est large (7+ à 15+) avec une intensité maximale pour le 10+. Le monomère est sous forme dépliée. En conditions natives, les pics les plus intenses sont dans la partie haute de la gamme de masse. Ils correspondent à du monomère ou du dimère en configuration native. Seul le pic à 2120 m/z ne correspond qu’à du dimère, il correspond à l’état de charge 9+. Les pics à 1900 et 2350 m/z peuvent correspondre à du dimère chargé 10+ et 8+ ou à du monomère chargé 5+

et 4+. Grâce à la présence d’adduits de potassium, on peut néanmoins déterminer qu’ils correspondent à un mélange de monomère et de dimère, le pic à 1900 m/z correspondant à environ 50% de chaque entité et celui à 2350 m/z ne correspondant pratiquement qu’à du monomère. Le pic à 1580 m/z pourrait correspondre à du dimère 12+ ou du monomère 6+, cependant il n’y a pas de pic correspondant à du dimère 11+. Le pic à 1580 m/z correspond donc forcément à du monomère chargé 6+.

Avec ces paramètres instrumentaux non-optimisés, l’intensité du pic caractéristique du dimère, le 9+, est inférieure à celle du pic caractéristique du monomère, le 6+.

Une fois les pics correspondant au dimère et au monomère ainsi identifiés, la tension d’accélération (Vc) a été variée manuellement pour étudier son effet sur l’intensité du pic caractéristique du dimère, à 2120 m/z (Figure 51).

Ces études ont été réalisées sur la gamme de masse 1800 – 2200 m/z. L’analyse du spectre précédent (Figure 50) a mis en évidence que le dimère apparaît sous deux états de charge, 9+

et 10+. La variation de la tension d’accélération a pour but d’optimiser l’intensité d’un seul pic, celui qui ne correspond qu’à du dimère, à 2120 m/z. Il est inutile d’optimiser celui à 1900 m/z car la part de dimère dans ce pic ne peut pas être précisément connue. L’optimisation a donc été réalisée en cherchant une intensité relative du pic à 2120 m/z par rapport à celui à 1900 m/z la plus élevée possible.

La tension d’accélération peut être modulée en changeant la tension appliquée sur le skimmer (VSK) et/ou celle appliquée sur la fin du capillaire de transfert (VCE). De nombreux voltages ont été testés séparément sur le skimmer ou sur le cap exit. L’intensité relative du pic à 2120 m/z par rapport à celui à 1900 m/z est maximale pour deux couples VCE / VSK testés de 15/200 V et 100/200 V qui correspondent respectivement à deux tensions d’accélération différentes, VC = 185 V et VC = 100V (Figure 51a et b)

Figure 51 : Spectres ESI-IT du dimère HUĮ2 en conditions natives à 10 µM dans NH4OAc 50 mM pH 5 avec un couple VSK/VCE de a) 15/200V (VC = 185 V), b) 100/200V (VC = 100V) , c) 15/360V (VC = 345V) et d) 150/360V (VC = 210V)

En revanche, avec les couples 15/360 V et 150/360 V, le dimère est pratiquement complètement dissocié (Figure 51 c et d). La variation du voltage du skimmer seul ne semble pas avoir d’effet sur la préservation du complexe. Seule la variation du voltage de la cap exit semble permettre d’optimiser cette préservation. Pour valider cette hypothèse, l’intensité relative du pic à 2120 m/z par rapport à celui à 1900 m/z a été suivie en faisant varier le voltage de la cap exit avec un voltage de skimmer fixe de 100V. La dissociation du dimère est minimale lorsque le voltage de la cap exit est d’environ 200V (Figure 52).

m/z

Intensité (a.u.)

m/z

a) Voltage skimmer/cap exit = 15/200V b) Voltage skimmer/cap exit = 100/200V

c) Voltage skimmer/cap exit = 15/360V d) Voltage skimmer/cap exit = 150/360V

10+ / 5+

/ 9+

10+ / 5+

/ 9+

5+ 5+

Intensité (a.u.)

0 2 4 6 8 x10⁴

0 1 2 3 4 5 6 x10⁴

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 x10⁵

1850 1950 2050 2150 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 x10⁵

1850 1950 2050 2150

Figure 52: Effet du voltage de la cap exit sur la quantité relative de dimère par rapport au monomère (avec un VSK fixe de 100 V)

Pour vérifier que le voltage appliqué sur le skimmer n’avait pas d’incidence sur la dissociation du dimère, la même étude a été réalisée en fixant le voltage du skimmer à 15V.

(Figure 53)

Figure 53 : Effet du voltage de la cap exit sur la quantité relative de dimère 9+ par rapport au monomère 5+ (VSK fixé à 15V)

La dissociation est de nouveau minimale lorsque le voltage appliqué à la cap exit est de 200 V. Pour deux valeurs de voltage appliqué sur le skimmer, 15 et 100 V, le voltage optimal à appliquer sur le cap exit est de 200 V. D’autres voltages de skimmer, intermédiaires entre 15

Ϭ Ϭ͕ϭ Ϭ͕Ϯ Ϭ͕ϯ Ϭ͕ϰ Ϭ͕ϱ Ϭ͕ϲ

Ϭ ϱϬ ϭϬϬ ϭϱϬ ϮϬϬ ϮϱϬ ϯϬϬ ϯϱϬ ϰϬϬ

sŽůƚĂŐĞĐĂƉĞdžŝƚ;sͿ

ŝŶƚĞŶƐŝƚĠĚŝŵğƌĞϵнͬŝŶƚĞŶƐŝƚĠŵŽŶŽŵğƌĞϱн

Ϭ Ϭ͕ϭ Ϭ͕Ϯ Ϭ͕ϯ Ϭ͕ϰ Ϭ͕ϱ Ϭ͕ϲ

Ϭ ϱϬ ϭϬϬ ϭϱϬ ϮϬϬ ϮϱϬ ϯϬϬ ϯϱϬ ϰϬϬ

Voltage cap exit (V)

intensitédimère 9+ / intensité monomère 5+

et 100 V, ont été testés et ont confirmé que le voltage optimal à appliquer à la cap exit est de 200 V.

1.2. Optimisation de la température de désolvatation

Deux acquisitions ont été réalisées à des températures de désolvatation de 120°C et 365°C, avec un voltage appliqué à la cap exit fixe de 200V (Figure 54). A 365°C, l’intensité relative du pic caractéristique du dimère, à 2120 m/z, par rapport à celle du pic à m/z 1900, est moins élevée qu’à 120°C.

Figure 54: Spectres ESI-IT du dimère HUĮ2 en conditions natives à 10 µM dans NH4OAc 50 mM pH 5 avec un couple VSK/VCE de 100/200V et une température de désolvatation de a) 120°C, b) 365°C

En conclusion, les conditions les plus douces pour étudier les dimères HU sont un voltage de la cap exit égal à 200V et une température de désolvatation de 120°C. Une température inférieure à 120°C n’a pas été testée pour éviter un encrassement trop rapide de la source.

L’optimisation des paramètres instrumentaux sur le système hPEBP1-GTP, archétype des complexes hPEBP1 - nucléotide qui composent le cœur de mon sujet de thèse, est présentée ci-après.

m/z

Intensité (a.u.)

m/z

a) T

= 120 ƒC b) T

= 365 ƒC

10+ / 5+

/ 9+

10+ / 5+

9+

/

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 x10⁵

1850 1950 2050 2150 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 x10⁵

1850 1950 2050 2150